重组黑曲霉表达菌株的制作方法

本发明属于微生物
技术领域：
，涉及一株重组黑曲霉表达菌株。
背景技术：
：葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase,GOD,E.C1.1.3.4)是一种需氧脱氢酶，该酶分子为二聚体，含有两个亚基，分子量约160kDa，每亚基结合一个FAD分子。它能利用分子氧作为电子受体，专一催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶由于具有催化专一性和高效性的优点，在食品、化工、医药、农业、饲料等领域有比较广泛的应用。由于葡萄糖氧化酶良好的应用效果，目前己经在很多行业中得到了广泛应用，近年来倍受关注，市场需求量也越来越大。GOD广泛分布于动植物和微生物体内，从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富，细菌GOD产酶量少。微生物发酵法是生产GOD的主要来源。目前市场上大部分商业产品都是由毕赤酵母和丝状真菌，如黑曲霉，米曲霉等发酵生产。丝状真菌作为细胞工厂生产有价值的产品(如酶)为人们熟知，其中尤以黑曲霉和米曲霉由于“通常认为安的”(GenerallyRecognizedAsSafe，GRAS)的特征而被广泛用于表达宿主，从而用于生产食品添加剂。GOD在食品工业中主要作用在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。目前，许多国家己将GOD作为公认的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中，例如：用于酒类除氧、蛋白脱糖、食品包装、果蔬及制品的保鲜。近几年，GOD作为一种新型的酶饲料添加剂，己被农业部列为12种允许使用的饲料酶制剂添加剂之一开始在畜牧、饲料行业上应用。在饲料中添加葡萄糖氧化酶能够清除牲畜肠道上皮细胞大量自由基，保护肠道上皮细胞的完整。葡萄糖氧化酶通过不断的催化葡萄糖生成葡萄糖酸，降低胃肠道的pH值，偏酸性环境有利于益生菌的生长增殖，从而抑制了病原微生物的存活，提高了牲畜的自身免疫力。除此之外，由于葡萄糖氧化酶在氧化葡萄糖过程中会产生过氧化氢，当过氧化氢积累到一定浓度时，可以抑制大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、弧菌等病原菌的生长繁殖，并且这种抑菌作用不会产生菌体抗药性。随着葡萄糖氧化酶制备提纯工艺的不断发展完善，使用成本的不断降低，葡萄糖氧化酶将在饲料行业中发挥越来越重要的作用。由于单酶的作用比较单一，目前饲料工业大多以复合酶为主。现有的复合酶有以下两种来源：(1)同一菌种在发酵过程中产生多种酶，以一种酶活高的酶为主活力，其它酶为副活力；(2)复合酶的另一种来源为不同菌种发酵生产的单酶，经过复配后形成复配酶产品。但该复合酶由于不是同一菌种生产，存在协调性和协同作用差，相互作用可能会存在干扰等缺点，因此开发以单菌种表达多酶系的菌株具有更加良好的应用效果和市场前景。技术实现要素：本发明提供了一株重组黑曲霉表达菌株及其应用，该重组黑曲霉表达菌株除了能高效表达葡萄糖氧化酶外，其表达产物还包含糖化酶，淀粉酶，蛋白酶等其它副表达产物。该菌株分类命名为黑曲霉(Aspergillusniger)，于2016年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号CGMCCNO.12518。本发明还提供了一种构建重组黑曲霉表达菌的方法。本发明还提供了一种生产葡萄糖氧化酶复合酶的方法。本发明还提供了一种葡萄糖氧化酶重组表达载体。本发明的目的通过以下技术方案实现：一株重组黑曲霉表达菌株，该菌株分类命名为黑曲霉(Aspergillusniger)，于2016年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNO.12518。上述的重组黑曲霉表达菌株在生产复合酶及制备动物饲料添加剂中的应用。一种构建重组黑曲霉表达菌的方法，构建包含葡萄糖氧化酶GOD基因序列的重组表达盒，该重组表达盒为包含葡萄糖氧化酶GOD基因序列、启动子、终止子、筛选标记等元件的基因片段，将该重组表达盒转化宿主细胞原生质体，曲霉转化技术原理遵循非同源断裂修复机理。该表达盒包含有选择标记，通过标记物筛选获得重组黑曲霉表达菌株。所述的葡萄糖氧化酶基因为曲霉、或青霉属来源葡萄糖氧化酶基因；优选为黑曲霉来源葡萄糖氧化酶基因；更进一步优选为具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；所述的宿主细胞为黑曲霉。为了构建葡萄糖氧化酶表达盒，首先需要选择必须的启动子。启动子可以是黑曲霉内源启动子，如黑曲霉糖化酶启动子，中性淀粉酶启动子，酸性淀粉酶启动子，α-葡萄糖苷酶启动子等。也可以是外源启动子，如米曲霉中性淀粉酶启动子，米根酶糖化酶启动子。也可以是启动子变体，如黑曲霉中性淀粉酶变体。与启动子3’末端连接的可以是调控序列，如合适的前导序列，即对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区，如米曲霉中性淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶前导序列。葡萄糖氧化酶基因可以选择黑曲霉内源基因，也可以来自其他种如米曲霉，青霉属。本发明优选黑曲霉来源葡萄糖氧化酶(GOD)。优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。所述的启动子和终止子可以通过设计相应的引物从曲霉基因组获得，所列举的启动子和终止子为本领域技术人员所公知的序列。本发明的载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophytoauxotrophs)等。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hyg(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉(Aspergillusnidulans)或米曲霉的amdS和hyg。构建重组黑曲霉表达菌的最优选技术方案的详细步骤为：(1)pUC57质粒经EcoRI-HindIII双酶切后得到的片段；(2)以SEQIDNO.1为模板，以GOD_F与GOD_R为引物，以SEQIDNO.2为模板，以hyg_F与hyg_R为引物分别通过PCR扩出带有重组臂的GOD基因和hyg基因，然后利用PCR通过GOD_F与hyg_R引物两端的重叠序列将GOD基因和hyg基因拼成一条直链长片段，再与具有末端互补序列的pUC57EcoRI-HindIII酶切线性回收片段进行重组，得到pGODHyg质粒；GOD_F：gaagtcagaattcatggtgttttgatcattttaaatttttatatggcgggGOD_R：agaaagagtcaccggtcactgtacatgcattgaatgacagtgatatcagcagahyg_F：gtacagtgaccggtgactctttcthyg_R：ctatgaccatgattacgccaagcttctcgagtggagatgtggagtg(3)将pGODHyg质粒HindIII酶切线性化后转化入黑曲霉原生质体；黑曲霉原生质体的制备及转化过程为本领域技术人员所公知的技术。(4)进行定性筛选及定量筛选得到包含重组黑曲霉表达菌。所述的黑曲霉为黑曲霉CICC2462。所述定性筛选的过程为：采用Fiedure.K.显色法，将转化的重组黑由霉菌株点种于平板分离培养基，培养至出现蓝色圈，进行蓝色圈大小定性比对，挑取变色圈较大的菌株接种至平板培养；所述定量筛选的过程为：将黑曲霉转化子摇瓶培养，离心收集上清液，测定上清液的葡萄糖氧化酶活性。一种生产葡萄糖氧化酶复合酶的方法，其特征在于：发酵培养上述的重组黑曲霉表达菌株使其表达以葡萄糖氧化酶为主的复合酶。一种葡萄糖氧化酶重组表达载体，采用以下方法构建：(1)pUC57质粒经EcoRI-HindIII双酶切后得到的片段；(2)以SEQIDNO.1为模板，以GOD_F与GOD_R为引物，以SEQIDNO.2为模板，以hyg_F与hyg_R为引物分别通过PCR扩出带有重组臂的GOD基因和hyg基因，然后利用PCR通过GOD_F与hyg_R引物两端的重叠序列将GOD基因和hyg基因拼成一条直链长片段，再与具有末端互补序列的pUC57EcoRI-HindIII酶切线性回收片段进行重组，得到葡萄糖氧化酶重组表达载体pGODHyg质粒；GOD_F：gaagtcagaattcatggtgttttgatcattttaaatttttatatggcgggGOD_R：agaaagagtcaccggtcactgtacatgcattgaatgacagtgatatcagcagahyg_F：gtacagtgaccggtgactctttcthyg_R：ctatgaccatgattacgccaagcttctcgagtggagatgtggagtg。本发明的有益效果：本发明构建的重组表达菌株除了能高效表达葡萄糖氧化酶外，其表达产物还包含糖化酶，淀粉酶，蛋白酶等其它副表达产物。以单菌种表达多酶系的菌株具有更加良好的应用效果和市场前景。该菌株表达的包含多酶组分的葡萄糖氧化酶在动物饲料领域具有良好的应用效果。附图说明图1pGODHyg质粒图谱图2GOD重组黑曲霉表达菌株在活性检测平板上的显色效果图图3GOD重组黑曲霉表达菌株摇瓶培养发酵液SDS-PAGE图4GOD重组黑曲霉表达菌株发酵酶液对肉鸡粪便的影响具体实施方式1.葡萄糖氧化酶重组表达质粒的构建该质粒包含以下几个部分：(1)pUC57质粒经EcoRI-HindIII双酶切后得到的片段；酶切过程为本领域技术人员所公知的技术。(2)葡萄糖氧化酶(GOD)表达盒，其中GOD序列来源于黑曲霉，由GenScript公司合成，序列如SEQIDNO.1所示；(3)选择标记Hyg表达盒，由GenScript公司合成，序列见SEQIDNO.2；首先分别用引物GOD_F与GOD_R、hyg_F与hyg_R分别以合成的GOD和筛选标记Hyg的表达盒为模板通过PCR扩出带有重组臂的GOD基因和hyg基因，PCR体系及过程为本领域技术人员所公知，然后利用PCR通过GOD_F与hyg_R引物两端的重叠序列将GOD基因和hyg基因拼成一条直链长片段，再通过ClonEZ(购自GenScript公司)方法与具有末端互补序列pUC57EcoRI-HindIII酶切线性回收片段进行重组，得到pGODHyg质粒，构建好的质粒图谱见图1。该质粒在GOD表达盒上游和Hyg表达盒下游分别加上了HindIII位点，以便线性化。引物名称引物序列GOD_FgaagtcagaattcatggtgttttgatcattttaaatttttatatggcgggGOD_Ragaaagagtcaccggtcactgtacatgcattgaatgacagtgatatcagcagahyg_Fgtacagtgaccggtgactctttcthyg_Rctatgaccatgattacgccaagcttctcgagtggagatgtggagtg2.GOD原生质体转化。原生质体的制备：在TZ液体培养基(牛肉膏粉0.8％(w/v，g/ml)；酵母浸膏0.2％(w/v)；蛋白胨0.5％(w/v)；NaCl0.2％(w/v)；蔗糖3％(w/v)；pH5.8)中培养黑曲霉菌丝体(黑曲霉CICC2462，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC)从培养液中过滤菌丝体并用0.7MNaCl(pH5.8)洗涤，菌丝体滤干后转移至含纤维素酶1％(w/v，g/ml)(Sigma)、蜗牛酶1％(w/v)(Sigma)和溶壁酶(Sigma)0.2％(w/v)的酶解液中。30℃，65rpm酶解2.5-3h。然后将含有原生质体的酶解液置于冰上并用四层擦镜纸过滤。得到的滤液3000rpm，4℃离心10min后，弃上清；附着在管壁上的原生质体用STC溶液(1MD-山梨醇、50mMCaCl2、10mMTris-HCl，pH7.5)洗涤一次，最后把原生质体重悬于适量的STC溶液中。原生质体的转化：将10μgpGODHyg质粒HindIII线性化DNA(4989bp)加入到100μl原生质体悬浮液中，混匀后室温放置25min；然后分三次共加入900μlPEG溶液(60％(w/v)PEG4000、10mMCaCl2、10mMTris-HCl，pH7.5)，混匀后室温放置25min；3000rpm，常温离心10min，收集原生质体，最后把原生质体重悬于1mlSTC溶液中。把该悬浮液与预先降温至45℃左右的TB3培养基(酵母浸膏0.3％(w/v)、酸水解酪蛋白0.3％(w/v)、蔗糖20％(w/v)、琼脂0.7％(w/v))混合并铺平板；待平板凝固后放入34℃培养箱中培养；24h后在平板上再铺一层含300ng/μl潮霉素(Hygromycin)的TB3固体培养基(琼脂1％(w/v)，其余成分同上)，继续将平板置于34℃培养箱中培养4-5天后，长出上层培养基的转化子即为阳性转化子。3.GOD黑曲霉重组表达菌株的平板筛选平板定性筛选：采用Fiedure.K.J显色法，挑取少量黑曲霉阳性转化子菌丝到活性鉴定平板，28℃培养1～2d后出现蓝色颜色圈，挑取变色圈较大的的菌株接种至平板培养。所述平板活性鉴定培养基组成如下：葡萄糖40g·L-1，蛋白胨2g·L-1，氯化钾0.5g·L-1，碳酸钙3.5g·L-1，可溶性淀粉10g·L-1，KI1.7g·L-1，脱氧胆酸钠0.2g·L-1，琼脂20g·L-1，磷酸缓冲液0.1mol·L-1pH5.5。4.GOD黑曲霉重组表达菌株的摇瓶培养将平板筛选得到的阳性转化子使用50mlYPM培养基(2g/L酵母提取物，2g/L蛋白胨，20g/L的麦芽糖)的摇瓶在34℃下，220rpm的摇床中培养六天，离心收集上清液，测定上清液的葡萄糖氧化酶活性。5.葡萄糖氧化酶的酶活测定在有氧条件下，GOD催化葡萄糖脱氢产生H2O2，在辣根过氧化物酶(POD)的作用下，氧供体邻-联(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色产物。根据其在540nm处吸光度的变化及标准曲线，可换算GOD的活性。酶活测定体系中包含2.5mL邻联茴香胺溶液，0.3mL的18％葡萄糖，0.lmL的90Um·L-1辣根过氧化物酶，35℃保温2min后，向试管中加入稀释好的酶液样品0.1mL，反应3min后，加入2mol·L-1硫酸终止反应，取出试管，测OD540,的吸光值，以热失活的酶液做空白对照。根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。试剂和溶液0.1mol/LpH5.5磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液：准确称取14.32g磷酸氢二钠，8.4056g一水合柠檬酸，溶解于400ml蒸馏水中，用磷酸氢二钠调节pH至5.5，备用。邻联茴香胺溶液：准确称取0.1g邻联茴香胺，溶于10ml甲醇中，此为储存液，4℃有效保存3天。实验前取0.1ml储存液，溶于12ml0.1mol/L，pH5.5的上述磷酸缓冲液，即得。18％葡萄糖：准确称取9.0000g烘干至恒重的葡萄糖(AR)，溶解于少量蒸馏水中，并用蒸馏水定容至50ml，4℃保存。2mol/LH2SO4：准确称取40.00gH2SO4，缓慢加入160mL蒸馏水中，定容至200mL，备用。GOD标准品：购买酶活为10000单位的sigma葡萄糖氧化酶标准品，准确加入5mL蒸馏水，混匀，-20℃保存备用。90U/mL辣根过氧化物酶：购买辣根过氧化物酶标准品(酶活力＞250units/mg，100mg)，准确加入1mL蒸馏水，充分溶解辣根过氧化物酶，-20℃保存备用。使用时取适量标准品稀释至酶活为90U/ml后使用，需现稀释现用。酶活力的测定(1)标准曲线的制作将GOD标准品分别稀释成0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4U/mL，在试管中加入2.5mL邻联茴香胺溶液和0.3mL的18％葡萄糖溶液，再加入0.1mL90U/mL辣根过氧化物酶溶液，35℃预热2min后，以15s的时间间隔加入0.1mL稀释好的GOD标准品，准确反应3min后立即加入2ml2mol/LH2SO4终止反应，取出混匀，在540nm处测定吸光值，以吸光值为横坐标，标准酶活力为纵坐标，绘制标准曲线y＝Kx+b。(2)样品的测定在试管中加入2.5mL邻联茵香胺溶液和0.3mL的18％葡萄糖溶液，加入0.1mL90U/mL辣根过氧化物酶溶液，35℃预热2min后，以15s的时间间隔加入0.1mL稀释好的待检样品(稀释标准为该样品的检测吸光值在线性范围内)，准确反应3min后立即加入2ml2mol/LH2SO4终止反应，取出混匀，在540nm处测定吸光值A，计算酶活。(3)酶活力的计算X＝(K*A+b)*n式中：X---样品的酶活力U/mlA---样品检测吸光值n---酶液的稀释倍数K----标准曲线斜率b----标准曲线截距6.GOD黑曲霉重组表达菌株的酶活测定及蛋白电泳分析经过平板及摇瓶活性筛选，得到了一株GOD表达量最高的黑曲霉重组表达菌株。该菌株分类命名为黑曲霉(Aspergillusniger)，于2016年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNO.12518。将该菌株使用50mlYPM培养基(2g/L酵母提取物，2g/L蛋白胨，20g/L麦芽糖)的摇瓶在34℃下，220rpm的摇床中培养六天。测定发酵酶液中GOD的酶活为1058U/ml，糖化酶活性为1009U/ml，较对照菌株有明显的下降，结果如表一。将发酵液进行浓缩到GOD酶活为10000U/ml后，参考各酶种活性国标检测方法，测定该菌株表达的浓缩酶液中不同酶组分的酶活表达水平，检测结果如表二。通过对发酵酶液蛋白电泳(SDS-PAGE)可以看到分子量大小约为大于120kDa的糖化酶蛋白条带，80kDa左右的葡萄糖氧化酶条带，60kDa的酸性淀粉酶条带和50kDa的中性淀粉酶条带。表一：重组黑曲霉表达菌株与对照菌株(黑曲霉CICC2462)主要酶活组分活性比较名称葡萄糖氧化酶(U/ml)糖化酶(U/ml)对照菌株未检出7516GOD重组表达菌株10581009表二重组黑曲霉表达菌株各酶活组分活性比较名称检测依据酶活(U/ml)中性蛋白酶GB/T23527-2009430葡萄糖氧化酶35℃，3min10000糖化酶GB8276-200610700真菌α-淀粉酶QB2526-2001363果胶酶QB1502-9240纤维素酶Q/0126NNE004-20123木聚糖酶GB/T23874-200914半乳糖苷酶Q/0126NNE005-201265过氧化氢酶37℃，pH7.001610中温淀粉酶GB/T24401-200949甘露聚糖酶Q/0126NNE002-2012未检出7.GOD重组黑曲霉表达菌株发酵酶液的动物实验选取1日龄罗斯308肉鸡，共4个鸡舍，每个鸡舍11000只鸡，随机分为对照组和试验组，每组2个鸡舍。对照组饲喂商品日粮+常乐(大蒜素与牛至油混合物由黑龙江省汇丰动物保健品有限公司提供)100mL/t，试验组饲喂商品日粮+GOD重组表达菌株发酵酶液100U/L，试验期自由采食、饮水，试验期42天，试验日粮由玉米、豆粕、小麦、棉粕、DDGS、花生粕、鸭油、预混料等组成，营养指标见表三。每天记录饲料消耗量，于21天及出栏时称重，并测定期间各栏饲料消耗量，统计各期的平均日饲料采食量、平均日增重，计算料肉比。试验期间观察粪便、腹泻及鸡群整体状况。表三.日粮营养水平爱益农510：动物饲料，河北爱益农饲料有限公司产品和美511：动物饲料，山东和美集团有限公司产品(1)GOD重组表达菌株发酵酶液对肉鸡的生产性能影响如表四所示：表四.GOD重组黑曲霉表达菌株发酵酶液对肉鸡的生产性能影响由结果可见，添加GOD重组黑曲霉表达菌株发酵酶液对鸡群整体状况有改善作用，就料肉比方面，1-21日龄，试验组较对照组降低2.98％，22日龄-出栏降低7.50％，全程料比降低6.05％。就日增重方面，GOD重组黑曲霉表达菌株发酵酶液添加提高了试验组鸡只日增重，后期表现明显(22日龄-出栏)，使得42日龄鸡只重量优于对照组。对照组、试验组间平均耗料量差异不明显。(2)GOD重组黑曲霉表达菌株发酵酶液对肉鸡粪便的影响选取1日龄罗斯308肉鸡，饲料中添加GOD重组黑曲霉表达菌株发酵酶液饲养5日后，可观察到5日龄试验组和对照组间腹泻情况的差别，对照组鸡只糊肛数量较多，试验组则情况较轻，见图4。由试验结果可知，GOD重组黑曲霉表达菌株发酵酶液的添加降低了料肉比，改善了肉鸡的生产性能。本实验中使用GOD重组黑曲霉表达菌株发酵酶液的试验组比使用常乐的对照组表现出一定优势，究其原因，可能是GOD重组黑曲霉表达菌株发酵酶液作用于饲料中葡萄糖，产生葡萄糖酸，降低肠道pH值，为消化酶更好地发挥其作用提供有利的pH值环境，提高酶原激活率，提高消化酶的活性，从而提高营养物质的消化吸收率。同时反应过程中消耗氧气，提供了厌氧环境，改善了肠道内微生态，促进乳酸菌、双歧杆菌等有益菌的生长繁殖，抑制了大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长。GOD重组黑曲霉表达菌株发酵酶液的添加对肉鸡肠道的发育有促进作用，能显著优化肉鸡小肠形态结构，为消化道的成熟和消化吸收提供了良好的物质基础。可见，GOD重组黑曲霉表达菌株发酵酶液的添加为肉鸡提供了一个更好的胃肠道消化环境，使肉鸡整体机体水平得到改善，从而表现为提高了肉鸡的生产性能。当前第1页1 2 3