一种提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法。
背景技术：
：肿瘤的过继性细胞免疫治疗是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞(特异性和非特异性的)直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀肿瘤细胞，可作为手术、放疗、化疗的补充，以提高疗效和改善患者的生存质量。因此，近年来一直是肿瘤生物治疗最活跃的领域。细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokineinducedkillercells，CIK)是将人体外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞群，它具有增殖能力强、杀瘤活性高、杀瘤谱广等特点。CIK细胞能选择性杀伤肿瘤细胞，无严格的主要组织相容性复合体(Majorhistocompatibilitycomplex，MHC)限制性，特别是对于术后清除微小转移灶、防止癌的扩散和复发、提高患者自身抗肿瘤免疫能力有重要作用。对于无法手术或对化疗耐受的中晚期肿瘤患者也可起到改善生活质量、延长生命的积极作用。提高CIK细胞的增殖率和杀伤力有助于提高过继性细胞免疫治疗的效果。技术实现要素：本发明的目的是提供一种诱导CIK细胞的方法，以提高CIK细胞的增殖率和杀伤力。上述目的是通过如下技术方案实现的：一种提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法：收集外周血的单个核细胞后进行诱导培养，诱导培养时在培养液中添加诱导增殖肽，利用诱导增殖肽作用于培养中的单个核细胞；所述诱导增殖肽为一种外源性多肽，序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述培养液为含20％小牛血清的RPMI1640培养液。优选地，所述诱导增殖肽作用于单个核细胞的浓度为10-20μmol/mL。优选地，所述培养液中还添加有γ干扰素、抗人CD3单克隆抗体和重组人IL-2。优选地，所述γ干扰素在培养液中的浓度为800-1200U/mL，所述抗人CD3单克隆抗体在培养液中的浓度为20-100ng/mL，所述重组人IL-2在培养液中的浓度为500-1500U/mL。优选地，所述的提高CIK细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法具体包括如下步骤：步骤S1，取外周血，收集外周血的单个核细胞部分，离心，弃上清液，获得单个核细胞；步骤S2，用完全培养液调整单个核细胞浓度为1×106/mL；所述完全培养液为含20％小牛血清的RPMI1640培养液，含有800-1200U/mL的γ干扰素和10-20μmol/mL的诱导增殖肽；步骤S3，培养24小时后，加入20-100ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500-1500U/mL重组人IL-2，继续诱导培养；以后每隔2-3天用含20％小牛血清的RPMI1640培养液半量换液，培养液中含20-100ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500-1500U/mL重组人IL-2；步骤S4，整个诱导培养过程为10-14天，即得高增殖率和杀伤率的CIK细胞。优选地，所述γ干扰素的浓度为1000U/mL。优选地，所述抗人CD3单克隆抗体的浓度为60ng/mL。优选地，所述抗人CD3单克隆抗体为OKT3、UCHT1、HIT3a中的一种或多种。优选地，所述重组人IL-2的浓度为1000U/mL。本发明的有益效果：本发明提供的方法可以显著提高CIK细胞的增殖率和杀伤力，有助于提高过继性细胞免疫治疗的效果。附图说明图1为CIK细胞的增殖倍数；图2为CIK细胞对K562靶细胞的杀伤率。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本发明的技术方案。实施例1：CIK细胞的诱导制备包括如下步骤：步骤S1，采用血细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集人外周血单个核细胞部分，离心，弃上清液，获得单个核细胞；步骤S2，用完全培养液调整单个核细胞浓度为1×106/mL；所述完全培养液为含20％小牛血清的RPMI1640培养液，含有1000U/mL的γ干扰素和15μmol/mL的诱导增殖肽；步骤S3，培养24小时后，加入60ng/mL抗人CD3单克隆抗体和1000U/mL重组人IL-2，继续诱导培养；以后每隔3天用含20％小牛血清的RPMI1640培养液半量换液，培养液中含60ng/mL抗人CD3单克隆抗体和1000U/mL重组人IL-2；抗人CD3单克隆抗体为OKT3、UCHT1、HIT3a的混合物，终浓度各为20ng/mL；步骤S4，整个诱导培养过程为12天，培养环境为5％CO2、37℃。培养结束后计数扩增倍数并进行细胞毒活性测定。实施例2：CIK细胞的诱导制备包括如下步骤：步骤S1，采用血细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集人外周血单个核细胞部分，离心，弃上清液，获得单个核细胞；步骤S2，用完全培养液调整单个核细胞浓度为1×106/mL；所述完全培养液为含20％小牛血清的RPMI1640培养液，含有800U/mL的γ干扰素和10μmol/mL的诱导增殖肽；步骤S3，培养24小时后，加入20ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500U/mL重组人IL-2，继续诱导培养；以后每隔2天用含20％小牛血清的RPMI1640培养液半量换液，培养液中含20ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500U/mL重组人IL-2；抗人CD3单克隆抗体为OKT3；步骤S4，整个诱导培养过程为14天，培养环境为5％CO2、37℃。培养结束后计数扩增倍数并进行细胞毒活性测定。实施例3：CIK细胞的诱导制备包括如下步骤：步骤S1，采用血细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集人外周血单个核细胞部分，离心，弃上清液，获得单个核细胞；步骤S2，用完全培养液调整单个核细胞浓度为1×106/mL；所述完全培养液为含20％小牛血清的RPMI1640培养液，含有1200U/mL的γ干扰素和20μmol/mL的诱导增殖肽；步骤S3，培养24小时后，加入100ng/mL抗人CD3单克隆抗体和1500U/mL重组人IL-2，继续诱导培养；以后每隔2天用含20％小牛血清的RPMI1640培养液半量换液，培养液中含100ng/mL抗人CD3单克隆抗体和1500U/mL重组人IL-2；抗人CD3单克隆抗体为OKT3、UCHT1、HIT3a的混合物，OKT3和UCHT1终浓度各为30ng/mL，HIT3a浓度各为40ng/mL；步骤S4，整个诱导培养过程为10天，培养环境为5％CO2、37℃。培养结束后计数扩增倍数并进行细胞毒活性测定。实施例4：实施例1的对比实施例，不添加诱导增殖肽包括如下步骤：步骤S1，采用血细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集人外周血单个核细胞部分，离心，弃上清液，获得单个核细胞；步骤S2，用完全培养液调整单个核细胞浓度为1×106/mL；所述完全培养液为含20％小牛血清的RPMI1640培养液，含有1000U/mL的γ干扰素；步骤S3，培养24小时后，加入60ng/mL抗人CD3单克隆抗体和1000U/mL重组人IL-2，继续诱导培养；以后每隔3天用含20％小牛血清的RPMI1640培养液半量换液，培养液中含60ng/mL抗人CD3单克隆抗体和1000U/mL重组人IL-2；抗人CD3单克隆抗体为OKT3、UCHT1、HIT3a的混合物，终浓度各为20ng/mL；步骤S4，整个诱导培养过程为12天，培养环境为5％CO2、37℃。培养结束后计数扩增倍数并进行细胞毒活性测定。实施例5：CIK细胞增殖倍数测定分别测定实施例1-4方法中CIK细胞的增殖倍数，结果如表1和图1所示。表1CIK细胞的增殖倍数实施例1实施例2实施例3实施例4增殖倍数36.32±7.4331.55±6.5439.87±8.799.46±1.77结果表明，本发明提供的诱导增殖肽可以显著提高CIK细胞的增殖率。实施例6：CIK细胞的细胞毒活性测定靶细胞为K562细胞株，效靶比5:1，1.8×105细胞总数/孔(96孔培养板)，每测量点设4个平行孔，效应细胞、靶细胞混合培养4h，加四甲基偶氮唑盐(MTT)孵育2h后去上清，加二甲基亚砜(DMSO)，酶标仪570nm处测吸光度(A)值，计算CIK细胞对靶细胞的杀伤率。实施例1-4制备的CIK细胞对靶细胞的杀伤率见表2和图2。表2CIK细胞对K562靶细胞的杀伤率(％)实施例1实施例2实施例3实施例4增殖倍数56.16±9.4850.44±8.9164.95±10.1328.78±3.55结果表明，本发明提供的诱导增殖肽可以显著提高CIK细胞对靶细胞的杀伤率。实施例7：诱导增殖肽的制备本发明诱导增殖肽通过Fmoc法固相合成制备。Fmoc法固相合成技术：合成反应按照从C端向N端进行，Rink介质上有自由氨基；每一步连接过程中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的HBTU，HOBt，DIEA和Fmoc-氨基酸；每次氨基酸的连接反应之后，都用一个吡啶/醋酸/N-甲基咪唑(3:2:0.5)的混合物来封闭未连接的自由氨基，封闭反应10分钟；每次氨基酸的连接反应之后，下一个氨基酸连接之前，都要把介质上的Fmoc-基团去掉，去Fmoc-基团使用含20％哌啶的二甲基甲酰胺，需15分钟；最后，所有氨基酸残基顺序连接后，用98％三氟乙酸从Rink介质上切割下来，切割在室温下进行2小时。经质谱鉴定确定为SEQIDNO.1所示序列。多肽的合成已经非常成熟，也可委托生物外包公司合成。研究发现，如下结构所示的六肽、七肽和八肽可以强化本发明诱导增殖肽对CIK细胞的诱导效果，进一步提高CIK细胞对靶细胞的杀伤力。六肽、七肽和八肽制备方法同实施例7。六肽：Lys-Trp-Cys-Ala-Glu-Ile七肽：Gln-Asp-Met-His-Gln-Leu-Gly八肽：Lys-Gln-Leu-Cys-Tyr-Met-Phe-Asp在实施例1诱导制备方法基础上，步骤S2完全培养基中再添加0.2μmol/mL的六肽或七肽或八肽，CIK细胞对靶细胞的杀伤率可以提高到(73.16±10.42)％、(76.35±11.46)％、(80.06±12.17)％。但是，若不添加诱导增殖肽，即便添加了六肽或七肽或八肽，CIK细胞对靶细胞的杀伤率也仅与实施例4基本一致，不超过30％。这表明，上述六肽、七肽和八肽可强化本发明诱导增殖肽对CIK细胞的诱导效果，但本身不具有提高CIK细胞杀伤力的作用。综上，本发明提供的方法可以显著提高CIK细胞的增殖率和杀伤力，有助于提高过继性细胞免疫治疗的效果。上述实施例的作用仅在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。当前第1页1 2 3