CYP71Z18基因及其编码蛋白与应用的制作方法

文档序号:12457328阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种CYP71Z18基因,其特征在于,该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的CYP71Z18基因的编码蛋白,其特征在于,该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求2所述的CYP71Z18基因的编码蛋白在调节和生产植物二萜类化合物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,包括以下步骤:

将pGGsC/pGGeC、pDEST14-OsKSL与pCDF-AtCPR1-CYP71Z18三种重组质粒各100-150ng同时加入40μL大肠杆菌C41(DE3)感受态细胞中,冰浴20min,42℃热激1min30s,冰上冷却2min后加入液体LB培养基200μL复苏2h,再涂布于同时含有氯霉素50mg/L、硫酸卡那霉素50mg/L和盐酸壮观霉素50mg/L的固体LB培养基平板上;37℃过夜培养,第二天挑选平均菌落,置于同时含有氯霉素50mg/L、硫酸卡那霉素50mg/L和盐酸壮观霉素50mg/L的5mL液体LB培养基中,37℃,过夜摇菌制备得到6种菌种;这些菌种为大肠杆菌C41(DE3)背景株系,且每个菌种分别含有三种质粒:

①pGGsC,pDEST14-OsKSL4,pCDF-AtCPR1-CYP71Z18;

②pGGsC,pDEST14-OsKSL8,pCDF-AtCPR1-CYP71Z18;

③pGGsC,pDEST14-OsKSL10,pCDF-AtCPR1-CYP71Z18;

④pGGsC,pDEST14-OsKSL11,pCDF-AtCPR1-CYP71Z18;

⑤pGGeC,pDEST14-OsKSL7,pCDF-AtCPR1-CYP71Z18;

⑥pGGeC,pDEST14-OsKSL10,pCDF-AtCPR1-CYP71Z18;

次日取1mL菌种置于50mL TB液体培养基,培养基中加入相应的抗生素,37℃,200rpm培养,菌液养至A600达到0.8-1.0,向其中加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达,并在诱导表达时加入细胞色素P450反应所需辅因子75mg/Lδ-氨基乙酰丙酸,1mM硫胺素,5mg/L核黄素;然后转至16℃,200rpm诱导培养72h;72h后用等体积的正己烷萃取萜类产物;所有的产物都经过叠氮甲烷甲基化后用于GC-MS检测羧酸类产物,制备得到羧酸类产物。

5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述液体LB培养基具体为:酵母提取物5g,胰蛋白胨10g,NaCl 10g,去离子水1L,用1mol/L的NaOH调PH值至7.0;高压灭菌,4℃保存;固体LB培养基在灭菌前加上15g/L的琼脂。

6.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述TB液体培养基具体为:NaCl 5g,MgSO4.7H2O 2g,酵母提取物24g,水解酪蛋白12g,甘油20mL,去离子水900mL;10×TB缓冲液:KH2PO42.31g,K2HPO412.54g,去离子水100mL;高压灭菌,4℃保存,使用时加入10×TB缓冲液100mL。

7.权利要求2所述的CYP71Z18基因的编码蛋白在水稻育种中的应用。

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