发明领域本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于高通量测序检测人brca1/2基因变异的质控方法及试剂盒。
背景技术：
：乳腺癌是一种严重影响妇女身体健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。据资料统计，其发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％。乳腺癌的发病常与遗传有关，另外，40-60岁之间，绝经期前后的妇女发病率较高。乳腺癌可分为散发性和遗传性两大类。其中遗传性乳腺癌约占乳癌发病率的5％-10％。乳腺癌易感基因brca1(thefirstfamilialbreastandovariancancersusceptibilitygene)和brca2(thesecondfamilialbreastcancersusceptibilitygene)存在可遗传突变，brca1或brca2突变基因携带者一生中患乳腺癌的危险性估计为90％。此外，brca1和brca2的突变也和卵巢癌有关。不论有无家族史还是发病年龄，所有卵巢癌中2-6％有brca1的突变，3-4％有brca2的突变。因此，筛选brca基因的突变也来越受到研究者的关注。brca1和brca2基因分别定位于17ql2_21和13ql2_13，编码序列分别为5711bp和10987bp，其表达有一定的组织特异性。brca1和brca2蛋白分别由1863个氨基酸和3418个氨基酸组成，这两个蛋白都具有granin蛋白的某些特征。brca1/2是两种具有抑制恶性肿瘤发生的基因，在调节人体细胞的复制、遗传物质dna损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用。拥有这个基因突变的家族倾向于具有高乳腺癌发生率，通常发生在较年轻时，病人的两侧乳房都患癌，且同时患有卵巢癌。如果brca1/2基因的结构发生了某些改变，那么它所具有的抑制肿瘤发生的功能就会受影响。截止2013年，已发现的brca1/2的突变有数百种之多。有学者总结了brca1和brca2基因突变相关的癌症的终身风险，显示有brca1基因突变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50％～85％和15％～45％，有brca2基因突变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50％～85％和10％～20％。通过对brca1/2的检测可筛检出乳腺癌、卵巢癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群，利于该类疾病的早期诊断治疗。高通量测序技术(highthroughputsequencing)又称二代测序技术(nextgenerationsequencing,ngs)，能一次并行对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，然后将测序结果与参考序列进行比对，找到dna分子上存在的突变信息。高通量测序技术是一种高效、精准的基因突变检测方法。目前国内尚无针对brca1/2基因检测的质控品和试剂盒。现有的针对胎儿染色体非整倍体(t21、t18、t13)检测使用半导体测序法，由于分析的目的不同，这样的检测分析的是染色体水平的变异，因此不能用于以靶向基因变异为目的的检测分析。其他的基因突变检测类产品，如egfr热点突变检测，采用了pcr-荧光探针法、荧光pcr-毛细管电泳法、流式荧光杂交法、fish、测序法、taqman-arms法等，由于仅能检测某一特定位点的突变，检测的效率低，成本高，而brca1/2基因的变异不存在特定的热点，变异的发生率无明显的位点特异性，因此常规方法不适合这类变异的筛查，不能很好地满足对于靶基因全编码区域都要求检测和分析的brca1/2基因检测的需求。技术实现要素：本发明的目的是提供一种基于高通量测序检测人brca1/2基因变异的质控方法及试剂盒。根据本发明的一个方面，提供人brca1/2基因变异检测质控品的制备方法，包括以下步骤：(1)选择brca1/2基因变异阳性的、可稳定传代的人肿瘤细胞系进行培养，分别提取各个细胞基因组dna并纯化，纯化后的dna分别稀释至相同浓度，得到质控品原料dna；(2)通过sanger测序法测定每个细胞系中brca1/2基因上的潜在变异位点，经sanger测序法确认的杂合和纯合变异位点作为阳性对照位点；(3)将来自不同细胞系的质控品原料dna按照一定比例混合，获得质控品。本发明的质控品中每一潜在变异位点上的变异频率值可以按照混合比例以及经sanger测序法测定的变异频率确定，计算公式如下：其中混合比例i是指所选择的第i个细胞系的基因组dna在质控品中的混合比例，变异频率i是指所选择的第i个细胞系的基因组dna在该位点上的变异频率。在上述制备方法中，步骤(2)还可以是：通过sanger测序法测定每个细胞系中brca1/2基因上的潜在变异位点，经sanger测序法确认的杂合和纯合变异位点作为阳性对照位点，确认为野生型的位点作为阴性对照位点。在优选的实施方案中，所选择的可稳定传代的人肿瘤细胞系是hcc1599、hct-15、jurkat和nci-h720细胞系。在进一步优选的实施方案中，将由hcc1599、hct-15、jurkat和nci-h720细胞系获得的质控品原料dna按照1-2：1：1：1的比例(体积积比)进行均匀混合。应当理解，根据本发明，所使用的细胞系包括但不限于hcc1599、hct-15、jurkat和nci-h720细胞系，可以使用其它人肿瘤细胞系。由hcc1599、hct-15、jurkat和nci-h720细胞系获得的质控品原料dna也可以按照其它比例进行均匀混合。本发明可以通过选取不同的细胞系，配置不同的质控品原料dna的比例，以及验证不同的变异位点来制备人brca1/2基因变异检测质控品。选取不同的细胞系、配置不同的质控品原料dna的比例时，所获得的质控品的变异位点、野生型位点和/或位点变异频率可能会有所不同，但不会妨碍其作为质控品的应用。在一些实施方案中，所述可稳定传代的人肿瘤细胞系的培养条件是：培养条件：37℃恒温，5％co2，湿度50％。培养至细胞密度达培养皿面积80-90％时传代。在一些实施方案中，所述提取细胞基因组dna是指在细胞生长对数期收集，800-1000r/min的速度离心取沉淀，抽提细胞基因组dna。在一些实施方案中，细胞基因组dna的纯化是指过柱纯化并洗脱。在优选的实施方案中，纯化后的dna分别被稀释至100±5ng/μl。在一些实施方案中，用tris-edta缓冲液稀释纯化后的dna。在优选的实施方案中，质控品原料dna要求外观是透明液体且无肉眼可见杂质，纯度为1.9＞od260/280＞1.7。根据本发明的另一个方面，提供通过上述方法获得的人brca1/2基因变异检测质控品。根据本发明的另一个方面，提供人brca1/2基因变异检测试剂盒，其中包含本发明的人brca1/2基因变异检测质控品。本发明的人brca1/2基因变异检测试剂盒还可以包含用于人brca1/2基因变异的高通量测序检测的任何其它组分。在优选的实施方案中，所述人brca1/2基因变异检测试剂盒进一步包含选自末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、dna连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、pcr预混液、接头封闭剂、dna封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库pcr引物、捕获探针、核酸纯化磁珠、链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。本发明的人brca1/2基因变异检测试剂盒任选地还可以包含阴性质控品。在特别优选的实施方案中，所述人brca1/2基因变异检测试剂盒包含上述全部试剂。根据本发明的又一方面，提供上述人brca1/2基因变异检测质控品或人brca1/2基因变异检测试剂盒在人brca1/2基因变异的高通量测序检测的质量控制中的应用。本发明所述的“高通量测序”也被称为二代测序，其主要特点是能够同时对输入的序列进行大规模平行测序，获得大量短序列的测序结果。高通量测序的基本原理是将待测dna随机打断成小片段，经末端修复、连接接头序列、pcr等步骤进行文库构建，最后使用illumina，iontorrent等测序仪进行测序。本发明的人brca1/2质控品可以作为阳性质控品。本发明的人brca1/2质控品也可以作为同时包含有阳性对照及阴性对照信息的单一质控品，单一样本检测即可满足质控要求。本发明的人brca1/2质控品包含不同的变异频率的变异位点，有利于控制分析准确性。本发明提供的人brca1/2基因变异检测质控品和试剂盒能够有效对人brca1/2基因变异的高通量测序检测体系的可靠性进行评估，提高了效率并降低检测质控成本。具体实施方式下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。实施例1：人brca1/2基因变异检测质控品的制备1.1.从atcc购买获得四个常用的可稳定传代人肿瘤细胞系hcc1599、hct-15、jurkat、nci-h720。1.2.采用专用培养基培养这四个人肿瘤细胞系，培养条件：37℃恒温，5％co2，湿度50％。培养至细胞密度达培养皿面积80-90％时传代，在细胞生长对数期收集，800-1000r/min的速度离心取沉淀，分别抽提每个细胞系的基因组dna，并过柱纯化、洗脱。1.3.将纯化后的每个细胞系的基因组dna分别用tris-edtabuffersolution缓冲液稀释至100±5ng/μl，外观为透明液体，无肉眼可见杂质，纯度为1.9＞od260/280＞1.7，得到质控品原料dna。1.4.用sanger测序法对每个细胞系的基因组dna进行测序，经sanger法确认的杂合和纯合变异位点作为阳性对照位点。经验证共含有27个阳性变异位点及660个野生型位点。1.5.将四种细胞系hcc1599、hct-15、jurkat、nci-h720的质控品原料dna按照1：1：1：1的体积比进行均匀混合，-20℃保存。实施例2：人brca1/2基因变异检测试剂盒的制备2.1.设计并合成针对人brca1/2基因上不同的目标区域的多个捕获探针，所有捕获探针的集合能够覆盖人brca1/2基因全部编码外显子区域及外显子内含子交接区域；捕获探针上具有生物素标记；所述捕获探针的序列如表1所示。表1人brca1/2基因变异检测杂交捕获探针序列2.2.将上述全部捕获探针按相同质量混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度1.5pm(pm＝皮摩尔/升)，-20℃保存。2.3.将捕获探针混合物和实施例1中获得的质控品分别分装。2.4.准备说明书、外包装，组装封口。2.5.其中捕获探针混合物的用量为6μl/3反应，12μl/6反应，24μl/12反应，48μl/24反应；质控品的用量为5μl/3反应，10μl/6反应，20μl/12反应，40μl/24反应。实施例3：人brca1/2基因变异的测序检测本实施例中测序所使用的仪器为nextseq500。阳性质控品的制备方法同实施例1。3.1.从20例阳性血液样本中提取人基因组dna，阳性质控品直接使用，无需提取。3.2.dna样本和质控品的片段化每个人基因组dna样本取200ng，质控品也取200ng，不足50μl的可用pcr-gradewater补齐至50μl，震荡混匀，短暂离心。随后将溶液全部转移至microtube中，选择片段长度为200～300bp的打断程序进行基因组dna样本和质控品dna的片段化。取5μl片段化后的样本进行琼脂糖凝胶电泳。3.3.文库构建3.3.1.末端修复和接头连接0.2mlpcr反应管，加入200～400ng打断后的基因组dna样本或质控品，用pcr-gradewater补齐至50μl，震荡混匀，短暂离心。分别加入3μl末端修复酶混合物和7μl末端修复反应缓冲液，震荡混匀短暂离心后在20℃保温30min，随后在65℃保温30min，进行末端修复。取出pcr反应管，短暂离心后分别加入2μl接头(含index标签)、10μldna连接酶、30μl连接反应缓冲液和8μlpcr-gradewater。震荡混匀，短暂离心后在20℃保温15min，进行接头连接。3.3.2.纯化取核酸纯化磁珠，平衡至室温。取步骤3.3.1中接头连接后的pcr反应管，短暂离心后，将产物全部转移至1.5ml离心管中。然后加入99μl核酸纯化磁珠，震荡混匀，室温静置5min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。随后加入200μl80％乙醇，静置1min后，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖静置3min。向管中加入22μlnuclease-freewater重悬磁珠，室温静置5min，转移至磁力架上静置1min，取20μl上清至新的0.2mlpcr反应管中备用。3.3.3.文库扩增与纯化向步骤3.3.2中的装有20μl上清的0.2mlpcr反应管中分别加入25μl2×pcr预混液和5μl文库扩增引物，震荡混匀，短暂离心后在pcr仪中按下述程序进行扩增：98℃1min；7-9个循环，每个循环为98℃15s，60℃30s，72℃30s；72℃1min；4℃保存备用。扩增后取出pcr反应管，短暂离心后将扩增产物全部转移至1.5ml离心管中。向离心管中加入45μl核酸纯化磁珠，震荡混匀，室温静置5min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。然后加入200μl80％乙醇，静置30s后，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖静置3min。向离心管中加入52μlnuclease-freewater重悬磁珠，室温静置5min，转移至磁力架上静置1min，取50μl上清至新的1.5ml离心管中备用。取2μl文库dna或质控品dna进行定量(使用qubit荧光定量仪)。3.4.文库捕获3.4.1.杂交每8个文库混合在一个样品池中进行杂交捕获，最后不足8个的混合在一个样品池中进行杂交捕获，将文库按量混合于1.5mllobind离心管中成为一个样品池，血液样本用量不低于125ng，样品池总量不超过1μg。向样品池中加入2μl接头封闭剂和5μldna封闭剂，震荡混匀，短暂离心后冷冻真空抽干。加入8.5μl杂交缓冲液(2×)、2.7μl杂交增强剂和3.8μlpcr-gradewater，震荡混匀，短暂离心后，室温静置5min重溶。将重溶后的液体全部转移至新的0.2mlpcr反应管中，95℃保温10分钟。取出pcr反应管，短暂离心后加入2μl实施例2获得的捕获探针混合物，震荡混匀3-5s，短暂离心后在65℃保温4h，热盖温度为75℃。3.4.2.富集取链霉亲合素磁珠洗涤后加入1倍体积磁珠洗液，振荡重悬后按每管100μl分装到不同的0.2mlpcr反应管中。将步骤3.4.1中的pcr反应管取出，短暂离心后将全部杂交产物转移至含有链霉亲和素磁珠的pcr反应管中，充分悬浮后于pcr仪上65℃孵育45min，期间每隔12min吸打混匀一次。孵育结束后，每管加入100μl65℃预热的1×洗液ⅰ，将全部悬液转移至1.5mllobind离心管中，震荡混匀，短暂离心后转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。加入200μl65℃预热的1×杂交洗液，震荡混匀，短暂离心后65℃孵育5min，转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。重复本步骤一次。再用磁珠洗液充分洗脱后加入18μlnuclease-freewater，震荡重悬后全部转移至0.2mlpcr反应管中备用。3.4.3.捕获文库扩增与纯化向上述pcr反应管中分别加入25μl2×pcr预混液和捕获文库pcr引物各2.5μl，充分混匀短暂离心后按下述程序进行pcr扩增：95℃3min；10个循环，每个循环为98℃20s，60℃30s，72℃30s；72℃1min；4℃保存备用。将pcr反应管短暂离心后，将产物全部转移至1.5ml离心管中。加入75μl核酸纯化磁珠，震荡混匀，室温静置10min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。加入200μl80％乙醇，静置30s后，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖晾干至无液滴残留。加入21.6μlnuclease-freewater震荡重悬磁珠，室温静置5min，转移至磁力架上静置1min，取20μl上清至新的1.5mllobind离心管中备用。取2μl捕获文库或捕获的质控品dna进行定量(使用qubit荧光定量仪)。3.5.测序及数据分析3.5.1.测序按照测序仪器及配套试剂使用说明进行上机测序。平均有效覆盖深度：血液样本≥300×。3.5.2.数据分析获得原始测序数据后，与参比数据库比对，进行变异分析和解读。检测结果如下：临床样本的突变位点及检测结果如表1所示。临床样本检测符合率：20/20＝100％。所有临床样本经sanger测序法验证无误。表1临床样本突变位点及检测结果阳性质控品的变异阳性位点及阴性(即野生型)位点检测结果如表2和表3所示，其中参考突变频率为根据混合比例以及经sanger测序法测定的变异频率计算获得的理论变异频率值，检测值为高通量测序实验检测结果。表2质控品变异位点及检测结果表3质控品变异阴性位点及检测结果由表2和表3的结果可见，阳性质控品中阳性变异对照符合率为100％，野生型序列对照符合率为100％。实施例4：可重复性实验按照实施例1的制备方法制备阳性质控品b-p1，与实施例1的不同之处在于四个细胞系dna按照2:1:1:1的体积比混合制备而成。按照实施例2的制备方法生产三批试剂盒，批号分别为20160126，20160127，20160128。按照实施例3的检测方法进行高通量测序检测。同一批次试剂盒20160126，检测b-p1三次，检测结果见表4。不同批次试剂盒20160126，20160127，20160128，检测b-p1各1次，检测结果见表5。表4批内差异批号样本名称阳性变异符合率野生型序列符合率20160126b-p1100％100％20160126b-p1100％100％20160126b-p1100％100％表5批间差异批号样本名称阳性变异符合率野生型序列符合率20160126b-p1100％100％20160127b-p1100％100％20160128b-p1100％100％检测结果：试剂盒可重复性满足要求。sequencelisting<110>埃提斯生物技术(上海)有限公司<120>基于高通量测序检测人brca1/2基因变异的质控方法及试剂盒<130>201610824194.6<160>631<170>patentinversion3.5<210>1<211>120<212>dna<213>人工序列<400>1aaaaaaatcaagaagaaactacttcaatttcaaaaataactgtcaatccagactctgaag60aacttttctcagacaatgagaataattttgtcttccaagtagctaatgaaaggaataatc120<210>2<211>120<212>dna<213>人工序列<400>2aaaaacgataaatggcaccaagaaaatgaaatactttgagaagctttccattaaatgaaa60atatatcatacaaattaattttagcacaggaattgaaatcacctagtatggaactacaag120<210>3<211>120<212>dna<213>人工序列<400>3aaaaagtaagaactagcaagactaggaaaaaaattttccatgaagcaaacgctgatgaat60gtgaaaaatctaaaaaccaagtgaaagaaaaatactcatttgtatctgaagtggaaccaa120<210>4<211>120<212>dna<213>人工序列<400>4aaaaagtatctttttgaaagttaaagtacatgaaaatgtagaaaaagaaacagcaaaaag60tcctgcaacttgttacacaaatcagtccccttattcagtcattgaaaattcagccttagc120<210>5<211>112<212>dna<213>人工序列<400>5aaaaagtggccattattgaacttacagatgggtggtatgctgttaaggcccagttagatc60ctcccctcttagctgtcttaaagaatggcagactgacagttggtcagaagat112<210>6<211>118<212>dna<213>人工序列<400>6aaaaatcatctctccgaaaaacaagatacttatttaagtaacagtagcatgtctaacagc60tattcctaccattctgatgaggtatataatgattcaggatatctctcaaaaaataaac118<210>7<211>111<212>dna<213>人工序列<400>7aaaaatgactgtaacaaaagtgcttctggttatttaacagatgaaaatgaagtggggttt60aggggcttttattctgctcatggcacaaaactgaatgtttctactgaagct111<210>8<211>120<212>dna<213>人工序列<400>8aaaataaaaatgcagccattaaattgtccatatctaatagtaataattttgaggtagggc60cacctgcatttaggatagccagtggtaaaatcgtttgtgtttcacatgaaacaattaaaa120<210>9<211>119<212>dna<213>人工序列<400>9aaaataactctcctgaacatctaaaagatgaagtttctatcatccaaagtatgggctaca60gaaaccgtgccaaaagacttctacagagtgaacccgaaaatccttccttggtaaaacca119<210>10<211>120<212>dna<213>人工序列<400>10aaaatatttcagaaaaagacctattagacacagagaacaaaagaaagaaagattttctta60cttcagagaattctttgccacgtatttctagcctaccaaaatcagagaagccattaaatg120<210>11<211>114<212>dna<213>人工序列<400>11aaaatgaagataacaaatatactgctgccagtagaaattctcataacttagaatttgatg60gcagtgattcaagtaaaaatgatactgtttgtattcataaagatgaaacggact114<210>12<211>120<212>dna<213>人工序列<400>12aaaatgtagaaaaagaaacagcaaaaagtcctgcaacttgttacacaaatcagtcccctt60attcagtcattgaaaattcagccttagctttttacacaagttgtagtagaaaaacttctg120<210>13<211>117<212>dna<213>人工序列<400>13aaaatgtttttaaagaagccagctcaagcaatattaatgaagtaggttccagtactaatg60aagtgggctccagtattaatgaaataggttccagtgatgaaaacattcaagcagaac117<210>14<211>120<212>dna<213>人工序列<400>14aaacacaacaaaaccatatttaccatcacgtgcactaacaagacagcaagttcgtgcttt60gcaagatggtgcagagctttatgaagcagtgaagaatgcagcagacccagcttaccttga120<210>15<211>120<212>dna<213>人工序列<400>15aaaccaaacccatgcaaaaggaccccatatagcacaggtacatgcaggcaccttaccatg60gaagccattgtcctctgtccaggcatctggctgcacaaccacaattgggtggacaccctg120<210>16<211>120<212>dna<213>人工序列<400>16aaacctttcattgtaatttttcagt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