一种鹿茸多肽在促肾上皮细胞增殖中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，涉及鹿茸多肽在促肾上皮细胞增殖中的应用。

背景技术：

鹿茸——归肝、肾经，补肾阳、益精血、强筋骨。属于传统中药之一。中华人民共和国药典(2005年版一部)将鹿茸功能与主治叙述为：壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒。用于阳痿滑精，冷宫不孕，赢瘦，神疲，畏寒，眩晕耳鸣耳聋，腰膝冷痛，筋骨冷软，崩漏带下，阴疽不敛。

鹿茸是隶属于脊索动物门哺乳纲鹿科的动物，它是梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化并且密生绒毛的幼角。鹿茸史载于《神农本草经》，指出：“鹿茸专入命门、督，兼入肝。甘咸气温，禀纯阳之质，含发生之气”，属中品。李时珍曰:“龟、鹿皆灵而有寿。鹿鼻常反向尾，能通督脉，故取其角，以补命、补精、补气，皆以养阳也。乃物理之玄微，神工之能事”。而且，现代药理研究亦表明，鹿茸有抗炎作用，可抑制和清除自由基，延缓衰老，促进创伤愈合等作用，鹿茸中提取的鹿茸多肽能够促进体外软骨细胞、成骨细胞的增殖和分化，抑制软骨细胞调亡，同时，文献研究也提示，以鹿茸等为代表的归肝、肾经药物在治疗“痹症”的方剂中使用频率占到39.3％。

鹿茸中含有比较复杂的化学成分，氨基酸的种类有19种以上，其中包括人体自身不能合成的必需氨基酸，10种磷脂成分，9种脂肪酸(生物活性最强的油酸、亚油酸、亚麻酸含量较高)、糖脂、糖，固醇类、激素样物质、前列腺素、脑素、核糖核酸、去氧核糖核酸、三磷酸腺苷、硫酸软骨素、多胺、肽类、脂蛋白、维生素、酶类及各种微量元素等。

本发明所用鹿茸多肽为利用离子交换层析、凝胶过滤层析及反相高效液相色谱层析等生物化学技术，从梅花鹿茸中分离得到的1个新多肽，SDS-PAGE电泳显示为一条带，HPLC图谱为单一峰，MALDI-TOF MS给出该多肽的精确分子量为3263.4，其等电点pI＝8.15.一级结构研究表明，该多肽是由32个氨基酸残基组成的直链多肽，不含半胱氨酸，富含缬氨酸、赖氨酸、亮氨酸和甘氨酸。(张郑瑶等."梅花鹿茸多肽的化学结构及生物活性."高等学校化学学报33.9(2012):2000-2004.)

肾损伤有以下特点；①合并伤多见，特别是肝、脾、胃肠道及胸部；②伤情重、休克发生率高；③多有血尿、腰痛、腹部包块等症状；④并发症多且较严重，如尿外渗、感染、高血压或肾功能不全等。肾损伤患者经常出现.血尿、休克等症状。表现有创伤性休克和出血性休克，甚至危及生命。而且大多数患者表现为疼痛及腹部包块，有时还可因输尿管血块阻塞引起肾绞痛。当肾周围血肿和尿外渗形成时，局部发生肿胀而形成肿块。高热及伤口流血也是肾损伤并发的症状。肾损伤后并发症分为早期和晚期两类。所谓早期并发症是指损伤后6周之内所发生的那些威胁病人生命，或者使损伤的肾脏丧失的情况，如继发性出血、尿外渗、肾周围脓肿、急性肾小管坏死、尿瘘等。晚期并发症包括高血压、肾积水、结石、慢性肾盂肾炎、慢性肾功衰竭、动静脉瘘等。这两类并发症大都发生于严重肾损伤之后，个别例外。高血压是晚期并发症中最常见者，发病率为0.7％～33％。主要原因是由于肾缺血引起肾素-血管紧张素系统活性增加，如肾蒂周围血肿、肾周围血肿、肾被膜下血肿机化、肾实质广泛瘢痕形成、肾内假性动脉瘤等对肾实质压迫造成供血不足，导致近球细胞及颗粒斑分泌肾素增多而继发肾素性高血压。肾损伤分为闭合性损伤和开放性损伤两种类型，主要由闭合性肾损伤及开放性肾损伤引起。肾损伤严重危机人的生命，因而，寻找到能够治疗肾损伤的药物，受到广泛的关注。本次实验所用鹿茸多肽，可以通过促进肾细胞的增殖来促进肾损伤修复，对临床治疗肾损伤具有借鉴意义。

技术实现要素：

为克服现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鹿茸多肽在促肾上皮细胞增殖中的应用。

本发明的技术方案为：

一种鹿茸多肽的氨基酸序列，其序列

VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM。

上述的鹿茸多肽在促肾上皮细胞增殖中的应用，包括如下步骤：

第一步，细胞培养；培养细胞为肾上皮细胞，使用高糖型培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

第二步，细胞消化；取处于对数生长期的肾上皮细胞，进行常规消化，得到单细胞悬液。

第三步，离心；将单细胞悬液放入离心管中进行离心；吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀。

第四步，细胞计数；调节细胞个数为5×10⁴～10×10⁴/ml。

第五步，种板；将分散均匀的细胞接种于孔板；孔板每列设置3～6个复孔；在37℃，5％CO₂培养箱中培养。

第六步，加入该氨基酸序列的鹿茸多肽；当肾上皮细胞处于对数生长期时，向孔板中加入0～500ug/ml的鹿茸多肽；在37℃，5％CO₂培养箱中培养24～48h。

第七步：采用MTT法检测细胞增值情况。

上述的肾上皮细胞为转染腺病毒基因的人肾上皮细胞派生得到。

上述的培养基为DMEM培养基。

上述第五步在接种细胞的周围孔中加入含有双抗的PBS溶液。

本发明的有益效果为，具有该种氨基酸结构的鹿茸多肽具有促进293T细胞增值的作用，在浓度为500ug/ml，作用时间为48h时效果最为显著，有助于促进肾损伤修复。

附图说明

图1表示不同浓度鹿茸多肽作用于293T细胞24h后，通过MTT法检测细胞增值的实验结果。

图2表示不同浓度鹿茸多肽作用于293T细胞48h后，通过MTT法检测细胞增值的实验结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

通过MTT法检测不同浓度鹿茸多肽作用于细胞24h后，对细胞增值的影响。

第一步：细胞培养。细胞培养使用高糖型DMEM培养基，血清含量为10％，使用75cm²细胞培养瓶，在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

第二步：细胞消化。取处于对数生长期的生长状况良好的肾上皮细胞(293T)，常规消化。消化时，先加入4ml PBS对肾上皮细胞(293T)进行清洗，清洗两次，洗去残留的培养基，防止残留培养基与胰酶发生中和作用。然后加入4ml胰酶，放入37℃、5％CO₂培养箱中消化1min。细胞皱缩时加入等量培养基终止消化。用一次性无菌塑料管吹打细胞瓶壁，将细胞从细胞培养瓶壁上吹打下来，制成单细胞悬液。

第三步：离心。将单细胞悬液放入离心管中进行离心，1000rpm/min离心5分钟。吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀。

第四步：细胞计数。使用细胞计数板计数，调节细胞个数为10×10⁴/ml(每孔加100ul，相当于每孔10000个细胞)。

第五步：种板。将分散均匀的细胞接种于96孔板，每孔加100ul，肾上皮细胞(293T)每列加5个孔，共需2.5ml，考虑到种板过程中细胞液的损失，需要配置3ml。四周孔中加入200ul含有双抗的无菌PBS。在第二列至第六列加入肾上皮细胞(293T)，每列设置5个复孔。37℃CO₂培养箱中培养24小时。

操作过程中需要注意的是：1.每次加入细胞都使枪头贴着孔壁(最好相同位置)，缓慢加入100ul细胞悬液。2.孔加入顺序：可从上到下，从右到左依次加入。3.为了保证细胞密度均匀，最好每加1列细胞混匀一下细胞悬液，避免因重力沉降导致细胞密度不均。4.每块96孔板加完细胞后，静置30min，使细胞贴壁。

第六步：加入鹿茸多肽。向孔板中分别加入不同浓度的鹿茸多肽、地塞米松及DMEM培养基。第二列至第四列中鹿茸多肽浓度分别为20ug/ml、100ug/ml、500ug/ml，第五列加入1mg/ml地塞米松，第六列加入等量的培养基。37℃CO₂培养箱中培养24h。

第七步：MTT法检测细胞增值情况。24h后取出孔板，每孔加入20ulMTT溶液(MTT溶液现用现配，也可以一次性配好后放于-20℃冰箱中长期冻存)，继续孵育4h后终止。快速、轻轻翻转培养板，弃上清，注意不能把结晶移走。每孔加入150ul DMSO，震荡10分钟，使MTT蓝紫色结晶逐渐溶解。用酶标仪检测490nm处各孔OD值(吸光值)，求每列平均值，只加入培养基孔的OD值为对照。最后，以时间为横轴，以OD值为纵轴绘制柱状图。此实验重复三次。

所得结果如图1所示，24h后实验组与对照组相比，实验组OD值明显大于对照组，呈现差异显著性，说明鹿茸多肽作用24h后显著促进细胞增值。

实施例2

通过MTT法检测不同浓度鹿茸多肽作用于细胞48h后，对细胞增值的影响。

第一步：细胞培养。细胞培养使用高糖型DMEM培养基，血清含量为10％，使用75cm²细胞培养瓶，在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

第二步：细胞消化。取处于对数生长期的生长状况良好的肾上皮细胞(293T)，常规消化。消化时，先加入4ml PBS对肾上皮细胞(293T)进行清洗，清洗两次，洗去残留的培养基，防止残留培养基与胰酶发生中和作用。然后加入4ml胰酶，放入37℃、5％CO₂培养箱中消化1min。细胞皱缩时加入等量培养基终止消化。用一次性无菌塑料管吹打细胞瓶壁，将细胞从细胞培养瓶壁上吹打下来，制成单细胞悬液。

第三步：离心。将单细胞悬液放入离心管中进行离心，1000rpm/min离心5分钟。吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀。

第四步：细胞计数。使用细胞计数板计数，调节细胞个数为10×10⁴/ml(每孔加100ul，相当于每孔10000个细胞)。

第五步：种板。将分散均匀的细胞接种于96孔板，每孔加100ul，肾上皮细胞(293T)每列加5个孔，共需2.5ml，考虑到种板过程中细胞液的损失，需要配置3ml。四周孔中加入200ul含有双抗的无菌PBS。在第二列至第六列加入肾上皮细胞(293T)，每列设置5个复孔。37℃CO₂培养箱中培养24小时。

操作过程中需要注意的是：1.每次加入细胞都使枪头贴着孔壁(最好相同位置)，缓慢加入100ul细胞悬液。2.孔加入顺序：可从上到下，从右到左依次加入。3.为了保证细胞密度均匀，最好每加1列细胞混匀一下细胞悬液，避免因重力沉降导致细胞密度不均。4.每块96孔板加完细胞后，静置30min，使细胞贴壁。

第六步：加入鹿茸多肽。向孔板中分别加入不同浓度的鹿茸多肽、地塞米松及DMEM培养基。第二列至第四列中鹿茸多肽浓度分别为20ug/ml、100ug/ml、500ug/ml，第五列加入1mg/ml地塞米松，第六列加入等量的培养基。37℃CO₂培养箱中培养48h。

第七步：MTT法检测细胞增值情况。48h后取出孔板，每孔加入20ulMTT溶液(MTT溶液现用现配，也可以一次性配好后放于-20℃冰箱中长期冻存)，继续孵育4h后终止。快速、轻轻翻转培养板，弃上清，注意不能把结晶移走。每孔加入150ul DMSO，震荡10分钟，使MTT蓝紫色结晶逐渐溶解。用酶标仪检测490nm处各孔OD值(吸光值)，求每列平均值，只加入培养基孔的OD值为对照。最后，以时间为横轴，以OD值为纵轴绘制柱状图。此实验重复三次。

所得结果如图2所示，48h后实验组与对照组相比，OD值具有明显的差别，说明鹿茸多肽作用48h后可以明显促进细胞增值，并且鹿茸多肽浓度为500ug/ml时促增值作用最为显著。

鹿茸多肽的氨基酸序列为：

VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM