一株产重楼皂苷Ⅵ的解淀粉芽孢杆菌clx‑60菌株及其用途的制作方法

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌菌株，该菌株可产重楼皂苷Ⅵ，属于微生物技术领域。

背景技术：

目前植物内生菌的研究逐渐受到重视，不同植物的各种内生菌相继被发现。内生菌种类的多样性也赋予了其代谢产物的多样性，这也预示着利用微生物代谢发掘生物、化学、医药等新资源具有巨大的潜力。大量的研究表明，植物内生菌可产生与宿主植物相同或相似的活性物质及前体，这一发现直接推动了植物内生菌尤其是药用植物内生菌研究的广泛展开。随着人们对药用植物内生菌的逐步研究，利用能够代谢产生相应活性成分的内生菌来生产新型、高效、低成本的活性药物，解决珍稀中药植物资源紧缺的现状，必将成为将来药用植物内生菌研究的重点。

虽然植物内生菌尤其是药用植物内生菌近些年来越来越受到广大学者的关注，但是目前仍然只开展了几百种植物的内生菌研究，而关于珍稀中药重楼的产药用成分内生菌的研究更是基本上仅现于国内。从重楼植物体中筛选出可代谢产生重楼皂苷、薯蓣皂苷及皂苷元的内生菌的研究为解决重楼药用成分紧缺的现状提供了一条新的途径，目前已有一些学者筛选出了一些产皂苷或其类似物的内生菌，但菌株数量及种类都不多，继续筛选出一些新的产皂苷或皂苷元的菌株，对深入开展微生物发酵产皂苷或皂苷元的途径的研究具有重要意义。

陈小静等从华重楼块茎中分离得到107株内生细菌，其中有6株能够产生薯蓣皂苷或其类似物，分别属于德克斯氏菌属、芽孢杆菌属、动性球菌属、肠杆菌属。张晓洁等从华重楼中分离得到16株内生菌，经筛选发现编号SNUS-1的菌株能代谢产生重楼皂苷或其类似物，并鉴定为托氏假单胞菌。任智等从华重楼中分离得到2株能代谢产生薯蓣皂苷的内生细菌RZ03和RZ07。魏超等从华重楼根茎中筛选出4株能够代谢产生薯蓣皂苷元的内生真菌(WD6H、WD7H、XIAZX和A221H)，分别属于腐皮孢霉菌、木贼镰刀菌、尖抱镰刀菌、大团囊菌科红曲霉。

重楼内生菌近几年来才开始受到人们的关注，总体来说，关于重楼内生菌尤其是能够代谢产生相应甾体皂苷成分的研究依然相对较少，并且大部分集中在华重楼方面，而滇重楼内生菌的研究也只限于内生真菌，鲜有关于产皂苷成分的滇重楼内生细菌的报道。

技术实现要素：

本发明解决了背景技术中的问题，提供了一种产重楼皂苷Ⅵ的解淀粉芽孢杆菌CLX-60菌株，该菌株可产重楼皂苷Ⅵ。

本发明人筛选到一株新型菌株，该菌株被命名为clx-60，属一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2016年9月7日，保藏编号为：CCTCC NO：M2016463；该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

上述解淀粉芽孢杆菌clx-60菌株能够用于发酵制备重楼皂苷Ⅵ。微生物发酵所采用的培养基配方为：蔗糖12g/L，豆粕15g/L，MgCl₂ 15g/L，最优培养条件为：pH值6.0，培养温度34℃，摇床转速150r/min。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌CLX-60菌株能够代谢产生重楼皂苷Ⅵ。本发明提供的菌株可以在短期内进行大规模发酵培养，且发酵成本较低，又不受时域、季节等条件限制，因此能够通过微生物发酵的途径解决重楼自然资源日益匮乏的现状，保证重楼药用资源的长期可持续利用。同时本发明中还提供了优化后的微生物发酵条件以及培养基的配方，重楼皂苷Ⅵ的产量较高。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌clx-60菌株第一次HPLC检测图；

图2为解淀粉芽孢杆菌clx-60菌株第二次HPLC检测图；

图3为解淀粉芽孢杆菌clx-60菌株的液质联用色谱检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。

菌株的分离、培养

本实施例中将买回来的新鲜种子用75％的乙醇进行表面消毒20min，然后用无菌水清洗3-5次，放入事先灭菌备用的研钵中，加5mL无菌水研磨成白色悬浊液。取300μL悬浊液于各个PDA培养基平板中，用无菌涂棒涂匀，待风干后用封口膜封口，于37℃恒温培养箱中培养5～9d，及时观察，并于第3、5、7、9d分别拍照记录，若真菌长满平板则不再进行分离，并灭菌处理。用牙签挑取平板上长出的细菌至LB固体培养基平板上进行反复纯化，直至得到单一的菌落。

同时将块茎洗净，除去坏死的表面硬物部分，然后横切成1cm²的薄片小块，先用75％的酒精浸泡3～5min，再用无菌水清洗2～3遍，洗去残余的酒精，再用无菌水浸泡大约5分钟，取出后用灭菌的滤纸吸干表面水分。将处理后的小块贴至PDA固体平板上，每个平板上放5片，封口膜封口后于恒温培养箱内37℃培养5-9d，每天观察、记录，对长出的细菌进行反复纯化。

将平板上纯化完成的细菌挑取至装有600μL LB液体培养基的1.5mL EP管中，封口膜封口，然后于37℃恒温摇床中190r/min摇床培养1d后，加入等体积的50％的甘油，混匀后于-80℃超低温冰箱中保存，每个菌株至少保存3份。

将保存的菌种取8μL接种到600μL LB液体培养基中，于37℃恒温摇床190r/min活化培养，24h后取8μL活化的菌种至三角瓶中的LB液体培养基中进行发酵，装液量60ml/100ml，37℃、190r/min摇床培养7d。经过以上发酵培养后，收集发酵液。

菌株的筛选

对各菌株发酵液样品中重楼皂苷I、II、VI、VII进行第一次检测，将其谱图、数据与标品数据进行比对，即可大致确定样品中是否含有相应重楼皂苷，再根据相应皂苷的标准曲线，即可算出相应样品中的相应皂苷含量。为避免其它物质可能带来的干扰，我们在改变色谱检测条件后，对第一次检测所得的阳性菌株发酵液进行第二次验证性定性检测，包括标品的检测和样品的检测。

经过以上检测后筛选得到一株产重楼皂苷Ⅵ的重楼内生菌，将其命名为CLX-60菌株。该菌株的发酵液中重楼皂苷Ⅵ的第一次HPLC检测如图1所示，clx-60菌株的重楼皂苷VI的平均产量为：0.238mg/L。该菌株的发酵液中重楼皂苷Ⅵ的第二次HPLC检测如图2所示。clx-60菌株的发酵液的液质联用检测图谱中发现了相应的离子流，如图3所示，进一步确定clx-60号菌株能够代谢产生重楼皂苷VI。

对该菌株进行分子鉴定

取保存的CLX-60菌种接种到装有5mL LB液体培养基的10mL培养瓶中，37℃、190r/min摇床培养3d。

内生细菌DNA的提取及电泳检测

16SrDNA的引物序列：

上游引物：16F(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)

下游引物：16R(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)

利用Sigma NA1020PCR产物回收试剂盒进行16SrDNAPCR产物的纯化回收。

16SrDNA片段与克隆载体的连接

将回收的16S rDNA片段与pMD 18-T Vector载体连接，轻弹混匀后，16℃连接6h或4℃连接12h。

连接产物转化感受态细胞

菌液PCR—克隆检测

采用通用引物进行菌液PCR，确定目的片段是否成功转化，筛选阳性克隆。

引物序列：M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

采用常规扩增反应体系及扩增程序，其中反应体系中以2μL菌液代替原3μL模板。取10μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对获得的相应阳性克隆进行分装、保种。

测序及序列比对、分析

阳性克隆送某生物技术有限公司测序，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。测序结果在GenBank核酸数据库中进行Blast相似性分析，经Blast序列比对及进化树分析，clx-60与Bacillus amyloliquefaciens strain SWM1的同源性为99％，与Bacillus amyloliquefaciens strain W16的同源性为99％，结合进化树，确定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens strain)。

菌株的保藏：

将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2016年9月7日，保藏编号为：CCTCC NO：M2016463。

发酵条件的优化

微生物的发酵培养基组分必须能够满足菌株菌株快速生长繁殖的需要，同时最适的发酵培养条件又能够保证其次生代谢物的大量积累。本发明通过单因素及正交试验实验对clx-60菌株的发酵培养基成分进行了优化，优化后的最适培养基配方为：蔗糖12g/L，豆粕15g/L，MgCl2 15g/L。确定了培养基组分及对应浓度之后，再进一步对该菌株代谢产生重楼皂苷Ⅵ的最适初始pH值、培养温度及摇床转速进行了优化，最终确定clx-60菌株的最适培养条件为：初始pH值6.0，培养温度34℃，摇床转速150r/min。