一种植物单染色体的显微分离方法与流程

本发明属于单染色体分离技术领域，具体涉及一种植物单染色体的显微分离方法。

背景技术：

染色体的微分离是随着分子生物学发展、结合了分子生物学和细胞遗传学技术而诞生的一种特异性基因克隆技术，能根据实验需要分离任何染色体或片段，然后创建有关DNA文库，并完成相关的分子生物学研究。染色体显微切割是指在显微镜下将染色体区段或目标染色体从标本中切割和分离出来的技术，是细胞遗传学和分子遗传学结合的桥梁。自创立以来，显微克隆与显微分离技术在人类和动物的病理研究、基因定位、文库构建、基因克隆等领域得到了广泛应用，并取得了显著的成效。不同植物的染色体分离时需要利用不同的方法，现有的微细玻璃针分离法主要应用于动物体细胞染色体分离领域，该方法存在对制片技术要求较高、操作技术难度大、染色体容易污染、效率不高等缺点，且不适用于植物单染色体的分离。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述不足，本发明要解决的技术问题是：针对现有单染色体分离技术操作难度大、染色体容易污染、效率不高的不足之处，而提供一种操作简单、分离效率高、分离效果好、染色体不被污染的植物单染色体的显微分离方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种植物单染色体的显微分离方法，先将需要进行单染色体分离的植物器官置于一氧化二氮气体中进行预处理，随后对预处理后的植物器官进行固定处理和酶解处理，将酶解后的植物器官破碎并配制成细胞悬液，将细胞悬液滴加到载玻片或盖玻片上得到染色体装片，向制得的染色体装片中滴加染料后放入倒置显微镜的视场光路中，在显微操作手的操作手臂上安装毛细管针，在倒置显微镜的观察下通过显微操作手调节毛细管针至目标染色体边缘，操控毛细管针将目标染色体分离。本发明针对采用现有的单染色体分离方法容易出现分离难度大、染色体容易污染的技术问题，通过创造性的研究提出前期制片时采用一氧化二氮对植物器官进行预处理，采用这样的预处理方法处理后的植物细胞经酶解后染色体更容易分散开，且采用滴片的方式进行制片，仅利用滴加时的重力就可以使植物细胞破裂，植物染色体中单个染色体之间分散效果更好，且这种滴片方式不会对染色体造成伤害，能够得到完整的、均匀分布、分散度较好的染色体，使后期分离的难度降低，避免了分离过程中染色体之间距离太近而引起的目标染色体被其他染色体污染问题，且染色体更加分散也使得分离效率提高。本发明借助显微操作手对植物单染色体进行分离，将装片置于显微镜下可以使操作者能够在可见的状态下选择目标染色体，并在分离过程中可以对分离的状态进行实时监控，采用显微操作手控制毛细管针进行染色体分离，不会对染色体带来负面影响，得到的单染色体形态和性状均保持原有状态。

进一步，在显微操作手的操作手臂上安装毛细管针时，使毛细管针与水平面的安装角度为30°。采用这样的安装角度，毛细管针尖与盖玻片接触的紧密度合适，轻微移动时不会影响到其他染色体和细胞的移动，进而便于进行染色体分离，且这样的安装角度在分离时不容易将毛细管针的针尖折断，便于单独吸附染色体或剥离开其他染色体；既避免了安装角度过小时针尖与装片表面的接触较多，容易把装片戳动，不利于毛细管针的移动，有可能会把整个细胞移动，影响分离效果的问题，也避免了安装角度过大时，针尖与装片之间接触太过陡立，针尖接触染色体装片时容易折断等的问题。

进一步，所述毛细管针的针孔直径为1~5 μm。本发明针对植物染色体的大小，选用这种针孔直径的毛细管针，不论是从针尖还是从针孔空隙来说都更适用于植物染色体的分离，且既避免了针孔直径过小使得针尖过细进而在挑取或剥离时容易被折断的问题，也避免了针孔直径过大而在显微镜视野中目标过大，容易触碰到其他常染色体，进而不利于染色体分离，容易使目标染色体受到其他染色体污染的问题。

作为优化，待染色体装片上的染料挥发至恰好粘附在所述染色体装片上时，再通过显微操作手操控毛细管针对目标染色体进行分离；恰好粘附在所述染色体装片上是指将染料挥发至将近干燥，晃动染色体装片染料恰好不在染色体装片上流动，且染料也没有在染色体装片上完全干燥成膜时。这样，可以避免染液过多时剥离出的染色体漂浮在染液中，如果空气流动，染色体会随之飘走，难以捕捉分离的单个染色体，也避免了染液完全干燥后，细胞内容物质和染液混在一起形成一层薄膜，同一个细胞中的染色体粘连在一起，不利于单条染色体分离的问题。

作为又一优化，当目标染色体周围有其他染色体和杂质存在时，先在倒置显微镜的观察下通过显微操作手操控毛细管针将目标染色体周围的染色体和杂质剥离，再在显微操作手上安装新毛细管针，在倒置显微镜的观察下通过显微操作手调节新毛细管针至目标染色体边缘，操控新毛细管针将目标染色体分离。这样的操作方法可以避免目标染色体被其他染色体或者杂质所污染，且将其他杂质和染色体分离后，目标染色体的分离难度也大幅降低，分离效率提高。

作为再一优化，当目标染色体周围有其他染色体和杂质存在时，先在倒置显微镜的观察下通过显微操作手操控毛细管针将目标染色体周围的染色体和杂质剥离，再在显微操作手上安装新的毛细管针，在毛细管针的一端连接注射器，并向所述染色体装片上添加水或染色，操控注射器利用注射器的吸力将目标染色体吸附入毛细管针中，达到分离目的。采用注射器的吸力强，将目标染色体吸附到毛细管针内，不容易使分离得到的单条染色体从毛细管上脱落，避免了粘取染色体时染色体分离后又脱落的问题。

作为另一优化，将分离得到的目标染色体粘附在毛细管针上，将粘附有目标染色体的毛细管针折断于TE缓冲液中，并进行离心处理后取上清液，得到植物单染色体。分离后的染色体再粘附在毛细管针上，可以降低分离的玉米单染色体受其他杂质污染的风险，采用TE缓冲液度对分离得到的单染色体进行溶解和重悬，使单染色体分离效果更好。

作为再一优化，先将需要进行单染色体分离的植物器官置于压力为0.5~1个大气压的一氧化二氮气体中进行预处理2~3 h，再采用体积浓度为90%的醋酸溶液对预处理后的植物器官进行固定处理2～3 h，随后采用纤维素酶和果胶酶对固定处理后的植物器官进行酶解处理5~6 h，将酶解后的植物器官破碎并配制成细胞悬液，将细胞悬液滴加到载玻片或盖玻片上得到染色体装片。采用这样的方法制得的染色体装片中染色体整体呈圆形或椭圆形、分散度好，减少了对染色体的伤害，得到了比较完整的染色体，便于进行后续的单染色体分离。

进一步，所述植物器官为玉米器官。本发明方法尤其适用于玉米器官中单染色体的分离，分离效果好、分离效率高，10~30分钟即可分离出1条染色体。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明采用一氧化二氮预处理加滴片制备染色体装片，获得的分裂相染色体呈圆形或椭圆形分散，分布均匀，染色体交叉少，分散度较好，并且该制备方法可以通过调整材料的浓度和滴片的高度控制染色体分散的程度，解决了显微分离植物单染色体样本制备难的问题。

2、采用本发明方法分离单染色体，借助于显微操作手，10～30分钟就可以分离出1条染色体，比现有的分离方法而言降低了操作的难度，提高了单染色体分离的效率 。

3、本发明对分离时间、毛细管针大小、下针角度及挑取方式进行了创造性研究，采用本发明方法分离单染色体，染色体被污染的概率降低，使分离得到的单染色体更加纯净，为今后开展植物分子遗传图谱和物理图谱构建、重要基因分离、染色体进化、比较基因组和单染色体测序等研究提供一个重要的实验技术。

附图说明

图1为本发明滴片法获得的染色体制片图；

图2为确定的目标染色体；

图3为毛细管针即将于载玻片接触；

图4为毛细管针与载玻片接触；

图5为调节毛细管针至目标染色体边缘；

图6为剥离目标染色体；

图7为将目标染色体粘附于毛细管针上；

图8为将目标染色体周围其他染色体和杂质全部剥离。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

下述实施例中使用的仪器耗材有笑气处理装置（包括笑气罐、减压阀和反应室，笑气罐的出气口处安装有减压阀，反应室通过管路与笑气罐的出气口相连通）、微量移液器，光照培养箱、恒温培养箱、冰箱、光学显微镜、移液器枪头、胶头滴管、滤纸、纱布、河沙、培养皿、镊子、刀片、离心管、载玻片、盖玻片、解剖针、剪刀、尼康倒置显微镜、尼康NT-88-V3显微操作手、拉针仪、电动显微注射仪和毛细管针。

使用的试剂有：1、体积浓度90%醋酸：将醋酸：超纯水按9:1体积比配成90%的醋酸溶液。2、质量体积浓度2.5%混合酶液：0.05g纤维素酶（R10）溶于1000ul柠檬酸钠缓冲液，配制质量体积浓度5%纤维素酶，分装于PCR管；0.05g果胶酶（y-23）溶于1000ul柠檬酸钠缓冲液，配制质量体积浓度5%果胶酶，-20℃保存。使用时两种酶液按体积比1:1混合，现配现用。3、体积浓度70%乙醇：将乙醇：超纯水按7:3体积比混合配成70%的乙醇溶液。4、TE缓冲液：量取下列溶液于500ml烧杯中：5ml浓度为1M Tris-HCl Buffer PH=8.0，1ml浓度为0.5M EDTA PH=8.0，向烧杯中加入400ml 超纯水均匀混合，将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存。

具体的玉米地方品种DP11单染色体显微分离步骤如下：

（1）取材

将玉米种子用温水泡30分钟后，让种子充分吸水膨胀，把浸泡过的种子均匀地平铺在沙盘中，放置时胚向上便于发根，放入25℃的恒温培养箱中培养。待种子胚根长到1-1.5 cm时，于上午9点-10点剪取根尖，放置于5 mL离心管。

（2）笑气预处理

把步骤（1）剪取的根尖清洗干净，用双蒸水蘸湿后用镊子将其装到5 mL离心管中，将湿润的根贴于管壁。将装有根尖的离心管放入笑气装置中，调节减压阀使笑气出气气压为0.5 MPa，用N₂O处理根尖2.5 h。

（3）固定

步骤（2）笑气预处理2.5小时后，松开阀门放气从反应室中取出离心管，向离心管中加入适量体积浓度为90%的冰乙酸溶液，放入4℃冰箱内固定2小时。

（4）保存

如果预处理后的材料不需要立即使用，可用自来水清洗2-3遍，放入新的离心管中，加入适量体积浓度为70%乙醇，4℃冰箱中保存，备用。

（5）酶解

从冰箱中取出保存液中的根尖，用清水清洗2-3遍。切掉根尖前端的0.5mm左右及后面的透明部分，把留下乳白色分生组织放在滤纸上除去多余水分，然后放入有配制好的质量体积浓度2.5%混合酶液的离心管内，每管大约放入2个根尖即可，将装有根尖的离心管放入恒温培养箱中37℃下酶解5h。

（6）离心

酶解处理过后，用移液枪移除酶液，加入体积浓度75%乙醇清洗2次，离心10s（6000r/min），然后倒掉上清液，再次用乙醇清洗后并再次离心一次。

（7）不同制片技术的比较

制片的好坏是能否成功分离玉米染色体的关键，清晰、分散度较好的染色体能显著降低染色体分离的难度，本实施例将采用常用的压片法、涂片法以及本发明采用的滴片法制片进行比较，结果发现，压片法压片时会使用一定的力度使原生质体分开，这使细胞紧紧的贴合于盖玻片或载玻片，若要分离单个的细胞或者染色体就要进行揭片，揭片时不能使染色体完全附着于盖玻片或者载玻片，得到的是不完整的染色体，或揭片后找不到目标染色体。涂片法在用解剖针将根尖细胞涂于玻片上时很容易破坏染色体，在烤片时高温也会破坏DNA，进而也不能分离得到完整无损的DNA。而本发明采用滴片法制片，利用自然的重力使细胞破裂，获得的分裂相较常规制片法染色体呈圆形或椭圆形分散，分布均匀，染色体交叉少，分散度较好，且可以通过调整材料的浓度和滴片的高度，控制染色体分散的程度，使得后期分离单染色体更加方便。

（8）镜检

将步骤（7）制得的染色体装片（图1）置于倒置显微镜上观察，找到清晰、分散好的染色体，并确定目标染色体（图2）。

（9）准备毛细管针

拧开氮气气罐阀门，打开PMP102拉针仪开关，分别选用仪器的程序4、9和11，可依次获到针孔直径为0.1-0.8um、1-5um和30-100um的毛细管针。分别选用0.1-0.8um、1-5um、30-100um针孔直径的毛细管针进行染色体分离，结果发现，在相同安装角度下，用相同的分离方式进行分离时，0.1-0.8 um的针孔直径太小不利于吸附，且针尖过细在挑取或拨离时易折断；而针孔直径为30-100 um时针尖在视野中的目标太大，容易触碰到其他常染色体，不利于对染色体的分离；1-5um针孔直径的毛细管针针尖，与玉米染色体大小相当，不论是针尖还是针孔空隙，都是较适合用于分离玉米染色体。

（10）安装毛细管针

取步骤（9）拉得的直径为1～5um针孔直径的毛细管针，将其安装于显微操作手的操作手臂上，分别选用15°、30°、45°的安装角度进行分离试验，结果表明，安装角度为45°时，太过陡立，针尖接触染色体时容易折断；15°时针尖与装片表面的接触较多，容易把装片戳动，不利于毛细管针的移动，有可能会把整个细胞给移动；而30°时针尖与盖玻片接触的紧密度较合适，轻微移动不会影响到其他染色体，针不容易折断，便于单独吸附染色体或拨离开其它染色体。

（11）下针

将步骤（8）已观察到的目标染色体置于倒置显微镜视野中央，在低倍镜下操控显微操作手下针，先快速将毛细管针调至视场光路的盖玻片上方有光亮处，再向下移动毛细管针，当从显微镜目镜中观察到黑色影子时，毛细管针即将于载玻片接触（图3），这时调节至高倍镜，缓慢向下移动毛细管针即可清晰看到毛细管针（从显微镜目镜中能同时观察到玉米染色体和毛细管针，图4）。

（12）染色体分离

分离的最佳时机是染液即将挥发完的时候，这时候晃动染色体装片染料恰好在染色体装片上维持平静状态、染料恰好不在染色体装片上流淌，再通过显微操作手操控毛细管针对目标染色体进行分离染液过多，剥离出的染色体会漂浮在染液中，如果空气流动，染色体会随之飘走；制片完全干燥后，细胞内容物质和染液混在一起形成一层薄膜，同一个细胞中的染色体将粘连在一起，不利于单条染色体的分离。如果染色体制片已干，可以滴加染液，待多数染液挥发掉，再分离染色体。

具体分离玉米单染色体时，通过显微操作手将毛细管针调节至目标染色体边缘（图5），先用毛细管针将目标染色体剥离出来（图6），再用毛细管针粘附剥离出的单染色体（图7）；当目标染色体周围都有染色体时，可先用毛细管针将其它染色体及杂质全部剥离开（图8），再换新的毛细管针粘附目标染色体，以防止目标染色体被污染。

另外，为了避免剥离的单染色体从毛细管针上脱离，当将其它染色体或杂质剥离后，可以采用吸附的方式分离染色体，在毛细管针的一端连接注射器（可以采用电动显微注射仪），向染色体装片中添加水或染液（只有在水或者染液中，注射器产生的吸力才能吸取染色体，空气中注射器吸力较小），通过注射器的吸力吸取染色体，将目标单染色体吸附到毛细管针内。

（13）染色体溶解剂保存

将粘附目标染色体的毛细管针折断于装有10 ul上述配制好的TE缓冲液中，瞬时离心后收集上清液，得到目标单染色体，-80℃保存目标染色体。

需要说明的是，植物细胞和植物染色体均具有相似性，采用本发明方法对各种植物细胞进行单染色体分离，均可以获得形态完整的单染色体，在此不一一列举。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。