本发明属于农产品加工领域，尤其涉及一种甘薯蛋白多肽的制备方法
背景技术：
甘薯(Ipomoea batatas)是旋花科甘薯属的一个重要栽培品种，原产于南美洲，因具有高产、稳产、抗干旱、耐瘠薄、适应性强、营养丰富等特点，在我国被广泛种植。甘薯块根除含有大量的淀粉外，还有2.24％～12.21％(以干物质计)的甘薯粗蛋白。甘薯蛋白含有丰富的18种氨基酸，其中人体必须的8种氨基酸含量均高于许多其他植物蛋白，具有很高的营养价值。由于未变形的甘薯蛋白具有胰蛋白酶抑制活性，影响其消化吸收，如使之生成小分子量的肽，会使其生物效价更高。同时研究表明甘薯蛋白多肽具有降血压、抗凝血、提高免疫力、抗肿瘤等功能，并对二苯基苦味肼基自由基(DPPH)具有一定的清除能力。因此，开发甘薯蛋白多肽具有重要的意义和价值。
常用制备蛋白肽的方法主要有三种。一是酸碱法，此法工艺简单，但副反应多，产品结构易改变，现在已不在采用。二是酶解法，即使用蛋白酶水解蛋白质生成肽，此法制备的多肽性能稳定，目前制备甘薯蛋白多肽多采用酶解法。石雨等采用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶水解甘薯蛋白生产甘薯蛋白多肽，测定不同酶解条件所得多肽的抗氧化活性，探索甘薯蛋白抗氧化多肽制备工艺[1]；吴广辉等利用Alcalase碱性蛋白酶水解甘薯蛋白，探讨了酶解条件对酶解效果影响，得到3个不同分子量的蛋白肽组分[2]。但不同蛋白酶的作用位点不同，具有很强的特异性，导致蛋白在作用过程中的酶解程度不高，另外酶的成本较高，这都使其应用受到了很大的影响。三是微生物发酵法，指利用微生物产生的蛋白酶来水解蛋白质，从而制备生物蛋白肽。微生物来源比较广泛、所产蛋白酶不用分离、生长周期不长、生产成本相对酶解法较低；微生物法制备的蛋白肽产率高，不需要进行脱苦处理，从而极大地减少了工艺流程、降低了生产成本。利用微生物制备多肽过程中影响因素较多，微生物的选择和发酵过程的控制很关键，目前该法制备甘薯蛋白多肽的研究很少见报道。
[1]石雨，王道园等.甘薯蛋白多肽的制备及其对DPPH自由基清除作用，食品科技，2010,35(5)，168-172.
[2]吴广辉，木泰华等.Alcalase碱性蛋白酶水解甘薯蛋白的研究，食品科技，2008,7,22-25.
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种甘薯蛋白多肽的制备方法，其能利用常见的微生物菌株制备甘薯蛋白多肽，改善多肽性能，提高多肽产率，降低生产成本。
为达到上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种甘薯蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将甘薯洗净去皮，粉碎后加水浸提，浸提液静置后过滤，弃去沉淀，留取上清液；
(2)将上清液离心后弃去沉淀，留取上清液为二次上清液；
(3)将二次上清液通过截留分子量为30kDa的超滤膜进行超滤浓缩，所得浓缩液为甘薯蛋白液；
(4)向甘薯蛋白液中加入碳源、氮源和无机盐，灭菌后放冷至室温，加入黑曲霉菌液，恒温振荡发酵72h；然后再加入枯草芽孢杆菌菌液，恒温振荡发酵38h，将发酵液离心，弃去沉淀，留取上清液，得到发酵上清液；
(5)将发酵上清液通过截留分子量为5kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得到的滤过液为甘薯蛋白多肽液，将其减压蒸馏浓缩，经冷冻干燥后得到甘薯蛋白多肽。
所述步骤(1)中加入甘薯4～5倍体积量的水浸提，浸提2～3次，合并浸提液静置6h～8h后采用板式法过滤，弃除甘薯纤维和大颗粒淀粉。
所述步骤(2)中离心速度为4000r/min，离心时间为10min～15min。
所述的黑曲霉菌液的制备为：以质量分数计，将2％可溶性淀粉、1％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、0.5％酵母粉、0.2％NaNO3加水配制黑曲霉培养基，灭菌后放冷至室温将黑曲霉接种到该培养基中，28℃以转速160r/min恒温振荡培养72h，得黑曲霉菌液；
所述的枯草芽孢杆菌菌液的制备为：以质量分数计，将0.5％酵母粉、2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％NaCl混合均匀，加水配制枯草芽孢杆培养基并调节pH至7.2，灭菌后放冷至室温，将枯草芽孢杆菌接种到该培养基中，30℃以转速160r/min恒温振荡培养24h，得枯草芽孢杆菌菌液。
以体积比计，黑曲霉和枯草芽孢杆菌的接种总量为12％～15％，黑曲霉与枯草芽孢杆菌的接种比例为2:1～1:1.5。
以质量分数计，向甘薯蛋白液中加入2％的葡萄糖作为碳源，加入0.3％的牛肉膏作为氮源，加入0.5％的NaCl作为无机盐。
所述的恒温振荡发酵时，黑曲霉的发酵温度为27℃～30℃，转速为160r/min；枯草芽孢杆菌的发酵温度为33℃～35℃，转速为160r/min。
所述发酵液离心时，转速为8000r/min，离心时间为10min～15min。
所述冷冻干燥是在-20℃下真空冷冻干燥。
相对于现有技术，本发明具有的有益效果：
本发明以甘薯蛋白液作为微生物发酵的主要原料，采用多菌种分步发酵工艺。先将黑曲霉接入发酵，一方面黑曲霉可以充分利用甘薯蛋白中的营养成分，促进自身的生长，直接参与生化代谢，通过自身作用对某些基团进行修饰和重组，使肽之间、肽与氨基酸之间发生移接、重排，以改善甘薯蛋白多肽的功能特性和加工特性；同时黑曲霉代谢产生丰富的酶系，如酸性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶，特别是活性较强的酸性蛋白酶，可以从两端切割肽链。
枯草芽孢杆菌对黑曲霉的生长具有影响作用，黑曲霉发酵至72h时，进入平稳期，产生的酶量和活力达到最高峰，之后开始产生黑色的孢子，菌体衰老破裂，给后续甘薯蛋白多肽的分离提取造成阻碍；因此枯草芽孢杆菌加入后，发酵条件改变，黑曲霉的生长和代谢受到抑制，孢子的产生延缓，而枯草芽孢杆菌所产蛋白酶主要是内切酶，酶的活性很强，能从蛋白内部进行水解切断肽链，生成小分子的多肽和氨基酸，枯草芽孢杆菌发酵至38h，开始进入衰亡期，故此时停止发酵。
本发明的的整个发酵过程中，微生物产生更加广泛的酶系，分别从蛋白的不同部位进行切割，将大分子的蛋白质降解成小分子的物质，协同配合，取长补短，大大提高多肽产率。本发明制备的甘薯蛋白多肽颗粒细腻，外观均匀，水解程度高达38.5％，肽链短，分子量介于6.2kDa-8.1kDa之间，性能稳定。
甘薯蛋白多肽的制备流程主要涉及粉碎、浸提、过滤、离心、超滤，这些工艺皆发展成熟，过程易控；制备蛋白的黑曲霉和枯草芽孢杆菌属于应用广泛的微生物工程菌，菌种的培育和发酵条件的控制要求简单，容易实现规模化的工业生产，两者都是安全的微生物，不会产生毒素，符合食品安全卫生的要求。另外，原料甘薯廉价易得，发酵辅料简单，生产成本较低。
具体实施方式
本发明提供一种甘薯蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将甘薯洗净去皮，粉碎后加水浸提，浸提液静置后过滤，弃去沉淀，留取上清液；
(2)将上清液离心后弃去沉淀，留取上清液为二次上清液；
(3)将二次上清液通过截留分子量为30kDa的超滤膜进行超滤浓缩，所得浓缩液为甘薯蛋白液；
(4)向甘薯蛋白液中加入碳源、氮源和无机盐，灭菌后放冷至室温，加入黑曲霉菌液，恒温振荡发酵72h；然后再加入枯草芽孢杆菌菌液，恒温振荡发酵38h，将发酵液离心，弃去沉淀，留取上清液，得到发酵上清液；
(5)将发酵上清液通过截留分子量为5kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得到的滤过液为甘薯蛋白多肽液，将其减压蒸馏浓缩，经冷冻干燥后得到甘薯蛋白多肽。
进一步的，所述的黑曲霉菌液的制备为：以质量分数计，将2％可溶性淀粉、1％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、0.5％酵母粉、0.2％NaNO3加水配制黑曲霉培养基，灭菌后放冷至室温，将黑曲霉接种到该培养基中，28℃以转速160r/min恒温振荡培养72h，得黑曲霉菌液；
所述的枯草芽孢杆菌菌液的制备为：以质量分数计，将0.5％酵母粉、2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％NaCl混合均匀，加水配制枯草芽孢杆培养基并调节pH至7.2，灭菌后放冷至室温，将枯草芽孢杆菌接种到该培养基中，30℃以转速160r/min恒温振荡培养24h，得枯草芽孢杆菌菌液。
黑曲霉和枯草芽孢杆菌的接种总量为12％～15％，黑曲霉与枯草芽孢杆菌的接种比例为2:1～1:1.5。
具体的，以质量分数计，向甘薯蛋白液中加入2％的葡萄糖作为碳源，加入0.3％的牛肉膏作为氮源，加入0.5％的NaCl作为无机盐。
下面给出具体的实施例。
实施例1
一种甘薯蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将甘薯洗净去皮，粉碎后加4倍体积量的水浸提3次，浸提液静置7h后过滤，弃去沉淀，留取上清液；
(2)将步骤(1)中上清液以4000r/min离心10min，弃去沉淀，留取上清液为二次上清液；
(3)将步骤(2)中的二次上清液通过截留分子量为30kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得到的浓缩液为甘薯蛋白液；
(4)称取2％(以质量分数计，下同)可溶性淀粉、1％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、0.5％酵母粉、0.2％NaNO3，灭菌后放冷至室温，将黑曲霉接种到该培养基中，28℃以转速160r/min恒温振荡培养72h，得黑曲霉菌液；
(5)称取0.5％(以质量分数计，下同)酵母粉、2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％NaCl混合均匀，调节培养基pH至7.2，灭菌后放冷至室温，将枯草芽孢杆菌接种到该培养基中，30℃以转速160r/min恒温振荡培养24h，得枯草芽孢杆菌菌液；
(6)向步骤(3)的甘薯蛋白液中加入2％(以质量分数计，下同)葡萄糖、0.3％牛肉膏、0.5％NaCl，灭菌后放冷至室温，加入步骤(4)黑曲霉菌液，转速160r/min，27℃振荡发酵72h，然后加入步骤(5)枯草芽孢杆菌菌液，转速160r/min，35℃振荡发酵38h，其中，黑曲霉菌液与枯草芽孢杆菌菌液接种比例为2:1，接种总量为发酵液的15％(以体积分数计)，将发酵液以8000r/min，离心15min，弃去沉淀，留取上清液；
(7)将步骤(6)上清液通过截留分子量为5kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得到的滤过液为甘薯蛋白多肽液，将其减压蒸馏浓缩，置于-20℃真空冷冻干燥,得甘薯蛋白多肽。
实施例2
一种甘薯蛋白多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将甘薯洗净去皮，粉碎后加5倍体积量的水浸提3次，浸提液静置6h后过滤，弃去沉淀，留取上清液；
(2)将步骤(1)中上清液以4000r/min离心15min，弃去沉淀，留取上清液为二次上清液；
(3)将步骤(2)中的二次上清液通过截留分子量为30kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得到的浓缩液为甘薯蛋白液；
(4)称取2％(以质量分数计，下同)可溶性淀粉、1％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、0.5％酵母粉、0.2％NaNO3，灭菌后放冷至室温将黑曲霉接种到该培养基中，28℃以转速160r/min恒温振荡培养72h，得黑曲霉菌液；
(5)称取0.5％(以质量分数计，下同)酵母粉、2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％NaCl混合均匀，调节培养基pH至7.2，灭菌后放冷至室温，将枯草芽孢杆菌接种到该培养基中，30℃以转速160r/min恒温振荡培养24h，得枯草芽孢杆菌菌液；
(6)向步骤(3)的甘薯蛋白液中加入2％(以质量分数计，下同)葡萄糖、0.3％牛肉膏、0.5％NaCl，灭菌后放冷至室温，加入步骤(4)黑曲霉菌液，转速160r/min，30℃振荡发酵72h，然后加入步骤(5)枯草芽孢杆菌菌液，转速160r/min，33℃振荡发酵38h，其中，黑曲霉菌液与枯草芽孢杆菌菌液接种比例为1:1，接种总量为发酵液的12％(以体积分数计)，将发酵液以8000r/min，离心10min，弃去沉淀，留取上清液；
(7)将步骤(6)上清液通过截留分子量为5kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得到的滤过液为甘薯蛋白多肽液，将其减压蒸馏浓缩，置于–20℃真空冷冻干燥,得甘薯蛋白多肽。
实施例3
一种甘薯蛋白多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将甘薯洗净去皮，粉碎后加5倍体积量的水浸提2次，浸提液静置8h后过滤，弃去沉淀，留取上清液；
(2)将步骤(1)中上清液以4000r/min离心15min，弃去沉淀，留取上清液为二次上清液；
(3)将步骤(2)中的二次上清液通过截留分子量为30kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得到的浓缩液为甘薯蛋白液；
(4)称取2％(以质量分数计，下同)可溶性淀粉、1％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、0.5％酵母粉、0.2％NaNO3，灭菌后放冷至室温将黑曲霉接种到该培养基中，28℃以转速160r/min恒温振荡培养72h，得黑曲霉菌液；
(5)称取0.5％(以质量分数计，下同)酵母粉、2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％NaCl混合均匀，调节培养基pH至7.2，灭菌后放冷至室温，将枯草芽孢杆菌接种到该培养基中，30℃以转速160r/min恒温振荡培养24h，得枯草芽孢杆菌菌液；
(6)向步骤(3)的甘薯蛋白液中加入2％(以质量分数计，下同)葡萄糖、0.3％牛肉膏、0.5％NaCl，灭菌后放冷至室温，加入步骤(4)黑曲霉菌液，转速160r/min，28℃振荡发酵72h，然后加入步骤(5)枯草芽孢杆菌菌液，转速160r/min，34℃振荡发酵38h，其中，黑曲霉菌液与枯草芽孢杆菌菌液接种比例为1:1.5，接种总量为发酵液的14％(以体积分数计)，将发酵液以8000r/min，离心15min，弃去沉淀，留取上清液；
(7)将步骤(6)上清液通过截留分子量为5kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得到的滤过液为甘薯蛋白多肽液，将其减压蒸馏浓缩，置于–20℃真空冷冻干燥,得甘薯蛋白多肽。