一种青稞TIFY9基因的克隆表达方法与流程

本发明涉及基因克隆与蛋白表达领域，具体公开了TIFY9基因的克隆及表达方法。

背景技术：

TIFY是一类新发现的植物中特有的基因家族，该家族基因由于编码蛋白序列中含有高度保守的TIF(F/Y)XG氨基酸序列，所以被命名为TIFY家族。目前的研究表明TIFY类基因受到了机械损伤、臭氧等非生物胁迫的诱导表达。

在拟南芥中已经发现JAZ10/TIFY9能够被伤胁迫和茉莉酸诱导表达。水稻中的TIFY家族基因有20个成员，其中有9个被茉莉酸诱导，几乎全部会被诸如盐、干旱、低温等非生物胁迫诱导，这表明TIFY家族与盐碱、干旱等有着密切的关系，对于包括TIFY9在内的TIFY基因家族进行深入的研究对于植物的耐盐、机械损伤胁迫的生理研究以及农业生产具有重要的意义。

尽管从2007年开始，人们对于拟南芥以及水稻中的TIFY家族基因进行了一定的研究，但是在青稞这种重要的粮食作物中的研究尚属空白，本次对TIFY9进行基因克隆与蛋白的表达将会为该基因在青稞中的研究提供极大的便利，为该粮食作物的增城提供有益的帮助。

技术实现要素：

本发明的目的包括：

提供一种一种青稞TIFY9基因cDNA的反转录PCR方法；

提供了一种TIFY9基因的PCR方法；

提供一种重组表达质粒pET28a-TIFY9；

提供一种重组表达质粒pET28a-TIFY9的制备方法；

提供一种重组表达质粒pET28a-TIFY9的表达方法。

具体的，本发明公开了一种青稞TIFY9基因cDNA的反转录PCR方法，包括以下步骤：

(1)提取青稞320和/或喜8种子苗株新鲜叶片的总RNA；

(2)使用反转录试剂盒进行反转录操作，采用20uL反应体系：在微量离心管中加入步骤(1)提取的总RNA5uL，加入4uL的5×RT Reaction Mix、1.4uL的Oligo(dT)、1uL的TUREscript H-RTase/RI Mix和8.6uL的8.6uL，混匀，离心；

(3)42℃加热50分钟，65℃加热15分钟；

(4)得到cDNA，-20℃保存。

其中，步骤(1)采用植物RNA试剂盒提取总RNA；步骤(2)采用反转录试剂盒进行反转录。

本发明还提供了一种TIFY9基因的PCR方法，包括以下步骤：

(1)按表1所示的反应体系，在微量离心管中加入TIFY9基因cDNA与引物1、引物2，引物1和引物2的核苷酸序列分别如序列表SEQ NO ID.1、SEQ NO ID.2所示；

(2)PCR反应条件：95℃5min预变性后进入循环；循环条件为：94℃1分钟,58℃1分钟，72℃1分钟；循环30次后，于72℃延伸10分钟。

表1 PCR反应体系

此外，本发明还提供了一种重组表达质粒pET28a-TIFY9，其核苷酸序列如序列表SEQ NO ID.5所示。

同时，本发明还提供了一种重组表达质粒pET28a-TIFY9的制备方法，包括以下步骤：

(1)pET28a载体与扩增得到的TIFY9基因用BamHI与Xhol进行双酶切，酶切条件如表2所示；

表2 pET28a载体和TIFY9基因的酶切条件

(2)取步骤(1)得到的pET28a载体酶切产物和TIFY9基因酶切产物，分别进行1％琼脂糖电泳后使用胶回收试剂盒对目的片段进行切胶回收；

(3)取0.2mL灭菌Eppendorf管一个，分别加入步骤(2)得到的pET28a(+)酶切回收片段4.5μl、TIFY9酶切回收片段0.5μl、的T4DNA连接酶缓冲液5.0μl，16℃连接过夜。

另一方面，本发明还提供了一种重组表达质粒pET28a-TIFY9的表达方法，包括以下步骤：

(1)将重组表达质粒pET28a-TIFY9转化表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞；同时将提取的空载体pET28a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)作阳性对照；BL21(DE3)感受态细胞不转化组作阴性对照；

(2)挑取LB固体培养基(含Kan100ug/mL)上生长的已转化入pET28a-TIFY9的BL21(DE3)菌落接种于5mL LB液体培养基(含Kan100ug/mL)；

(3)37℃振荡培养至OD600约为0.5时，取1mL按1:100比例接种于含Kan的LB液体培养基中；

(4)将培养的100mL培养液分为2份，其中一份加IPTG诱导表达，另一份不加IPTG作为对照；加入IPTG至终浓度为1mmol/L，转速为220rpm，继续25℃培养16h；

(5)取IPTG诱导后菌液1mL，离心，弃上清，沉淀用生理盐水洗涤后，加入100ul生理盐水及5×SDS上样缓冲液25ul，100℃煮沸10min，离心，取上清进行SDS-PAGE；对未诱导菌液做同样处理，观察表达情况；同时将LB液体培养未转化及空载体pET28a(+)转化的BL21作为对照。

本发明首次公开了从青稞植物中提取RNA克隆TIFY9基因的方法，根据本发明提供的方法可有效的获得和表达TIFY9基因，为下一步的品种培育和筛选提供了有益选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想的前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或者变更。

以下通过实施例形式的具体实施方法，对本发明的上述内容在做进一步的详细说明，但不应理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1酶切验证实验图谱

M:DNA分子量marker

1：pET28-TIFY9的BamHI与XhoI双酶切产物

图2a、图2b PET28-TIFY9测序结果与已知目的基因的序列比对

14 TIFY9 10020455为基因组TIFY9基因

14-1 T7为重组表达质粒Pet28a-TIFY9

图3 pET28a-TIFY9在BL21中蛋白表达的SDS-PAGE电泳图谱

M：标准蛋白分子量

1：含载体Pet28a-TIFY9菌未诱导

2：含载体Pet28a-TIFY9菌诱导

3：含载体Pet28a-TIFY9菌诱导上清

4：载体Pet28a-TIFY9菌诱导沉淀

以下为具体实施方式

第一RNA抽取及cDNA逆转录PCR

1.RNA抽提及反转录

1.1用青稞320及喜8种子发芽成长成苗

1.2采取新鲜叶片用植物提取试剂盒抽提RNA并检测，

1.3提取步骤如下：

1.3.1仪器与试剂

主要仪器：SCILOGEX D3024R离心机、analytikjena-Easycycler；Scientz-48高通量组织研磨仪；

主要试剂：反转录试剂盒(TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit)(艾德来,货号PC1802，)；2×预混液(德国DBI pcrMix)。

1.3.2实验方法与步骤

1.3.2.1组织样本中RNA的提取

RNA提取试剂盒采用jena innuPREP RNA Mini Kit。

1.3.2.2 cDNA的合成(反转录)

采用Aidlab公司反转录试剂盒(TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit)进行反转录操作，采用20uL反应体系(各反应500ul体系用于后续PCR)：

反转录反应条件如下：

反应结束后，得到cDNA，-20℃保存。

2.GIFY9基因的PCR扩增

2.1按表1所示的反应体系，在微量离心管中加入TIFY9基因cDNA与引物1、引物2，引物1和引物2的核苷酸序列分别如序列表SEQ NO ID.1、SEQ NO ID.2所示；

2.2 PCR反应条件：95℃5min预变性后进入循环；循环条件为：94℃1分钟,58℃1分钟，72℃1分钟；循环30次后，于72℃延伸10分钟。

表1 PCR反应体系

3.PCR产物电泳及编辑

3.1仪器与试剂

主要仪器：电源、电泳仪、成像系统。

主要试剂：琼脂糖、500ml 1XTAE、marker、Gold view。

3.2实验方法与步骤：

3.2.1制备1％琼脂糖凝胶:称取0.5g琼脂糖置于锥形瓶中,加入50ml1×TAE.电磁炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0％琼脂糖凝胶液.

3.2.2胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固(30min),垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.

3.2.3加样:用10ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内(2ul),每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.

3.2.4电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压130V,13min,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.

3.2.5观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存。

第二：回收PCR产物测序亚克隆并诱导表达，以及重组表达菌株的构建

1.目的基因DNA片段的回收及鉴定

1.1 TIFY9基因目的DNA片段的PCR产物纯化回收

用10g/L琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，凝胶回收试剂盒回收目的片段。步骤如下：

(1)切取含目的片段的琼脂糖后捣碎，按重量/体积比1:3(琼脂糖重量：NE结合液的体积)加入NE结合液。如200mg琼脂糖加600mL NE结合液；

(2)50～60℃水浴3～5min，胶完全融化即可，其间可上下颠倒2～3次；

(3)将溶液转入离心纯化柱中，静置5min使DNA充分与硅胶膜结合，13000r/min离心10～20秒，倒掉收集管中的废液；

(4)加入500μl的80％乙醇于离心纯化柱中，13000r/min离心10～20秒，倒掉收集管中的废液；

(5)重复步骤(4)；

(6)13000r/min再次离心1min，尽量除去残余乙醇；

(7)将离心纯化柱置于新的离心管中，开盖放置2～3min，使乙醇挥发完；

(8)将无菌TE溶液50℃预热，向离心纯化柱中加入40～50μl，静置3～5min，使洗脱液充分将硅胶膜浸透；

(9)13000r/min离心1min，管底溶液即为所需的DNA。

1.2目的基因的鉴定

使用本领域常规方法，对TIFY9目的基因测序，目的基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO ID.3所示。

现有技术公开的TIFY9基因序列如序列表SEQ NO ID.4所示

经过序列比对，经本发明PCR方法得到了高纯度、仅有少数几个突变的TIFY9基因。

2制备感受态细胞BL21(DE3)

(1)从37℃培养16～20h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3mm)，转到一个含有100mL LB培养基的中，于37℃剧烈振荡培养2h后，每隔30min测OD600至0.5左右；

(2)将细菌转移到一个无菌，用冰预冷的50mL聚丙烯管中，使培养物冷却至0℃；

(3)于4℃以4000r/min离心10min，以回收细胞；

(4)倒出培养液，将管倒置1min，以使最后的痕量培养液流尽；

(5)每50mL初始培养液用20mL，0.1mol/L CaCl2和10mL，0.1mol/L MgCl2在冰上放置30min，溶液重悬每份沉淀，置冰水混合物中10min；

(6)于4℃以4000r/min离心10min，以回收细胞；

(7)倒出上清液，将管倒置1min，以使最后的痕量上清液流尽；

(8)每50mL初始培养液用2mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬每份细胞沉淀。细胞在4℃保存12～24h，以提高转化效率。

以上操作均在无菌条件下进行。

3.重组表达质粒pET28a(+)-TIFY9的制备、鉴定与表达

3.1将含有质粒pet128(+)的菌株培养后，抽提质粒，并用BamHI和XhoI双酶切，酶切体系见表2，37℃作用2h，凝胶回收试剂盒回收目的DNA。

将TIFY9基因PCR纯化回收产物用BamHI和XhoI双酶切，酶切体系见表4-5，37℃作用2h，凝胶回收试剂盒回收目的DNA。

表2质粒与PCR产物的酶切反应体系

4酶切回收产物pET28a(+)与TIFY9酶切回收片段的连接和鉴定

4.1连接：

取0.2mL灭菌Eppendorf管一个，分别加入步骤3中的pET28a(+)酶切回收片段与TIFY9酶切回收片段，按表3加入各成分后16℃连接过夜，得重组表达质粒pET28a-TIFY9。

表3连接反应体系

4.2测序和鉴定

使用酶切验证对目的基因进行验证，酶切验证实验的鉴定结果，见图1。酶切图谱显示，目的基因经BamHI与XhoI双酶切后得到TIFY9和28a两个条带，证明pET28-TIFY9载体的构建成功。

对重组表达质粒pET28a-TIFY9进行测序，和现有技术已知TIFY9基因序列进行比对，比对实验结果见说明书附图2所示，克隆得到的序列与目的序列一致。

5诱导表达

5.1重组表达质粒pET28a-TIFY9转化表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞。同时将提取的空载体pET28a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)作阳性对照；BL21(DE3)感受态细胞不转化组作阴性对照。

5.2重组蛋白的诱导表达

诱导表达使用的条件为0.1mM IPTG，25℃，16h。

5.3重组表达菌株的培养及表达

挑取LB固体培养基(含Kan100ug/mL)上生长的已转化入pET28a-TIFY9的BL21(DE3)菌落接种于5mL LB液体培养基(含Kan100ug/mL)；

37℃振荡培养至OD600约为0.5时，取1mL按1:100比例接种于含Kan的LB液体培养基中；

将培养的100mL培养液分为2份，其中一份加IPTG诱导表达，另一份不加IPTG作为对照。加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养

改变IPTG浓度、诱导温度和培养时间获得最佳诱导表达条件。

取IPTG诱导后菌液1mL，离心，弃上清，沉淀用生理盐水洗涤后，加入100ul生理盐水及5×SDS上样缓冲液25ul，100℃煮沸10min，离心，取上清进行SDS-PAGE。对未诱导菌液做同样处理，观察表达情况。

同时将LB液体培养未转化及空载体pET28a(+)转化的BL21作为对照。

6.重组表达质粒工程菌表达蛋白的SDS-PAGE电泳检测

(1)按说明装好垂直电泳槽，保证封口胶条对槽口的密封。根据目的蛋白的大小及电泳槽规格确定分离胶及浓缩胶的浓度及体积；

(2)配置所需浓度的分离胶，速将其注入凝胶装置，留出灌注浓缩胶所需空间，用吸管小心在分离胶面上覆盖一层水，将凝胶垂直放置于室温下；

(3)分离胶聚合完全后，凝胶和水之间出现一条明显的交界线，倾出覆盖层液体，用滤纸吸干残留液体；

(4)配制所需浓度的浓缩胶，在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶，并将梳子插入浓缩胶中，应避免产生气泡，将凝胶垂直放置于室温下，聚合45min左右；

(5)浓缩胶聚合完全后，小心取出梳子。将凝胶固定于电泳槽上，上下槽中均灌注Tris-甘氨酸电泳缓冲液；

(6)按预定顺序加样，打开电源，恒压电泳。先以60V低电压电泳，当染料前 沿进入分离胶后，把电压调至120V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部；

(7)电泳完毕后取出凝胶，用去离子水漂洗净胶上的电泳缓冲液，将凝胶放入固定液中固定15min，以考马斯亮蓝染液染色，于65℃染色15～20min,然后以脱色液平缓摇动脱色3～5h，观察蛋白条带发现，在预期的分子量24kDa位置出现明显的诱导条带，蛋白诱导表达成功。SDS-PAGE电泳图谱(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱)见图3。