本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种头孢菌素C的发酵方法。
背景技术：
：头孢菌素C(英文全称为CephalosporinC，缩写为CPC)，是由顶头孢霉菌(Cephalosporiumacremonium)产生的一类β-内酰胺抗生素，分子式为：C16H21N3O8S，分子量为415.4，结构式为：头孢菌素C的结构与青霉素的结构相似，不同的是头孢菌素C的母核是7-氨基头孢烷酸(7-ACA)，而青霉素的母核则是6-氨基青霉烷酸，正是由于这种结构上的差异，使得头孢菌素C有着更强的稳定性。头孢菌素类C因其抗菌谱广和不良反应发生率低的特点，是临床上广泛使用的消炎、抗菌药物，也是生产各种注射用半合成头孢菌素的基本原料。头孢菌素C主要采用发酵法生产，产量不够高，发酵过程中易产生大量杂质，例如DOCPC(脱乙酰氧头孢菌素C)，因此需要对其发酵工艺进行改进。但是，由于头孢菌素C发酵是一个受多种代谢调控反应控制的复杂的生物合成过程，发酵过程中反应步骤较多，影响因素多，例如培养基成分、发酵液粘度、溶氧、菌体浓度等多种因素都会影响产量，而且各个因素之间会相互影响，因此对头孢菌素C发酵工艺进行优化较为困难。目前的研究理论认为，补水可以提高溶氧量，因此补水工艺可以在一定程度上提高发酵的产量，但是实践发现，通过补水大幅度提高产量的难度大，与发酵的其他条件息息相关，补水工艺难以确定。因此，未见关于头孢菌素C发酵的具体补水工艺的报道，也未见补水工艺可以降低头孢菌素C杂质含量的报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种含有补水工艺的头孢菌素C的发酵方法。本发明提供了一种头孢菌素C的发酵方法，它包括如下步骤：a、取顶头孢霉菌，制备一级种子、二级种子；b、取步骤a制备的二级种子，接种至顶头孢霉菌发酵培养基中发酵，发酵30～110h后进行补水；c、取步骤b所得发酵液，分离纯化，即得头孢菌素C。其中，步骤a所述顶头孢霉菌为保藏号为ATCC36225的顶头孢霉菌。其中，步骤b所述发酵的条件为：发酵时间为130h；0～40h的温度为28℃，40～130h的温度为24℃；pH为5.6。其中，步骤b所述补水的体积为发酵液总体积的5～20％。进一步的，所述补水的时间为发酵40～80h后，补水的体积为发酵液总体积的10～12％。更进一步的，所述补水的时间为发酵60h后，补水的体积为发酵液总体积的12％。其中，步骤b所述补水的流加量为100～500L/h。其中，步骤b所述补水的停止时间为发酵开始后120h。其中，步骤b中，在发酵过程的以下时间段内补入葡萄糖溶液和植物油，工艺如下：葡萄糖溶液：40～80h，连续流加4～11g/L·h；80～130h，连续流加9～21g/L·h；植物油：50～90h，连续流加1～6g/L·h；90～130h，连续流加3～8g/L·h；其中，葡萄糖溶液的浓度为600-700g//L。其中，步骤b所述发酵培养基包括如下成分：步骤b所述发酵培养基包括如下成分：玉米浆39～76重量份、植物油49～71体积份、葡萄糖4～13重量份、水解淀粉19～31重量份、甲硫氨酸2～9重量份、花生粉9～21重量份、消泡剂1.4～4体积份、碳酸钙4～11重量份、硫酸镁1～6重量份、硫酸铵7～16重量份、硫酸亚铁0.04～0.1重量份、硫酸锰0.01～0.05重量份、硫酸锌0.01～0.05重量份、硫酸铜0.01～0.05重量份。所述重量份和体积份的关系为：重量份每g对应体积份每ml。进一步的，所述发酵培养基包括如下成分：玉米浆50重量份，豆油55体积份，葡萄糖8重量份，水解淀粉26重量份，甲硫氨酸4重量份，花生粉15重量份，消沫剂2体积份，碳酸钙6重量份，硫酸镁4重量份，硫酸铵13重量份，硫酸亚铁0.09重量份，硫酸锰0.03重量份，硫酸锌0.025重量份，硫酸铜0.025重量份。DOCPC为头孢菌素C生产过程中的关键杂质，该杂质含量在提取过程中极难除去，因此在源头减量成为减少DOCPC含量的关键。本发明提供一种发酵生产头孢菌素C的方法，在发酵过程中特定的时间内进行补水，可同时达到头孢菌素C单罐批产量提高、DOCPC杂质含量显著降低的效果，大幅度降低成本，工业应用前景良好。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。具体实施方式下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。实施例1本发明发酵生产头孢菌素C的方法1、发酵方法(1)制备一级种子取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(m重量份/体积份)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。(2)制备二级种子取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。(3)发酵取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h24℃，pH为5.6。发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。发酵培养30h开始流加无菌水，每小时的流加量在100～500L/h，流加至120h停止，累计加量为发酵液体积的15％。培养期间，发酵罐进行补料：在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。2、实验结果发酵结束后，取发酵罐发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测:取1g发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测效价。色谱条件如下：色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1mL/min，进样量：20uL。放罐总十亿为头孢菌素C的产量单位。发酵罐容积为500m3。放罐总十亿的计算方式为：十亿＝效价(μg/mL)*体积(m3)/1000发酵实验结果见表1：表1发酵实验结果补水时间(h)补水量放罐总十亿DOCPC组分(％)3015％2734.40.83实施例2本发明发酵生产头孢菌素C的方法1、发酵方法(1)制备一级种子取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(m重量份/体积份)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。(2)制备二级种子取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。(3)发酵取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h24℃，pH为5.6。发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。发酵培养40h开始流加无菌水每小时的流加量在100～500L/h，流加至120h停止，累计加量为发酵液体积的12％。培养期间，发酵罐进行补料：在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。2、实验结果发酵结束后，取发酵罐发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测:取1g发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测效价。色谱条件如下：色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1mL/min，进样量：20uL。放罐总十亿为头孢菌素C的产量单位。发酵罐容积为500m3。放罐总十亿的计算方式为：十亿＝效价(μg/mL)*体积(m3)/1000发酵实验结果见表2：表2发酵实验结果补水时间(h)补水量放罐总十亿DOCPC组分(％)4012％2747.80.79实施例3本发明发酵生产头孢菌素C的方法1、发酵方法(1)制备一级种子取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(m重量份/体积份)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。(2)制备二级种子取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。(3)发酵取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h24℃，pH为5.6。发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。发酵培养60h开始流加无菌水，每小时的流加量在100～500L/h，流加至120h停止，累计加量为发酵液体积的12％。培养期间，发酵罐进行补料：在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。2、实验结果发酵结束后，取发酵罐发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测:取1g发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测效价。色谱条件如下：色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1mL/min，进样量：20uL。放罐总十亿为头孢菌素C的产量单位。发酵罐容积为500m3。放罐总十亿的计算方式为：十亿＝效价(μg/mL)*体积(m3)/1000发酵实验结果见表3：表3发酵实验结果补水时间(h)补水量放罐总十亿DOCPC组分(％)6012％2861.40.65实施例4本发明发酵生产头孢菌素C的方法1、发酵方法(1)制备一级种子取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(m重量份/体积份)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。(2)制备二级种子取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。(3)发酵取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h24℃，pH为5.6。发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。发酵培养80h开始流加无菌水，每小时的流加量在100～500L/h，流加至120h停止，累计加量为发酵液体积的10％。培养期间，发酵罐进行补料：在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。2、实验结果发酵结束后，取发酵罐发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测:取1g发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测效价。色谱条件如下：色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1mL/min，进样量：20uL。放罐总十亿为头孢菌素C的产量单位。发酵罐容积为500m3。放罐总十亿的计算方式为：十亿＝效价(μg/mL)*体积(m3)/1000发酵实验结果见表4：表4发酵实验结果补水时间(h)补水量放罐总十亿DOCPC组分(％)8010％2796.30.88实施例5本发明发酵生产头孢菌素C的方法1、发酵方法(1)制备一级种子取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(m重量份/体积份)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。(2)制备二级种子取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。(3)发酵取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h24℃，pH为5.6。发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。发酵培养100h开始流加无菌水，每小时的流加量在100～500L/h，流加至120h停止，累计加量为发酵液体积的8％。培养期间，发酵罐进行补料：在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。2、实验结果发酵结束后，取发酵罐发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测:取1g发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测效价。色谱条件如下：色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1mL/min，进样量：20uL。放罐总十亿为头孢菌素C的产量单位。发酵罐容积为500m3。放罐总十亿的计算方式为：十亿＝效价(μg/mL)*体积(m3)/1000发酵实验结果见表5：表5发酵实验结果补水时间(h)补水量放罐总十亿DOCPC组分(％)1008％2716.10.91实施例6本发明发酵生产头孢菌素C的方法1、发酵方法(1)制备一级种子取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(m重量份/体积份)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。(2)制备二级种子取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。(3)发酵取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h24℃，pH为5.6。发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。发酵培养110h开始流加无菌水，每小时的流加量在100～500L/h，流加至120h停止，累计加量为发酵液体积的5％。培养期间，发酵罐进行补料：在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。2、实验结果发酵结束后，取发酵罐发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测:取1g发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测效价。色谱条件如下：色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1mL/min，进样量：20uL。放罐总十亿为头孢菌素C的产量单位。发酵罐容积为500m3。放罐总十亿的计算方式为：十亿＝效价(μg/mL)*体积(m3)/1000发酵实验结果见表6：表6发酵实验结果补水时间(h)补水量放罐总十亿DOCPC组分(％)1105％2694.60.93对比例1现有方法制备头孢菌素C1、发酵方法(1)制备一级种子取保藏编号为ATCC36225的顶头孢霉菌茄子瓶斜面，制备的菌悬液25％(m重量份/体积份)。按照1％的接种量接种至种子培养基中，在pH为7.0、27℃培养50h。一级种子培养基：玉米浆20g，豆油35mL，葡萄糖13g，蔗糖10g，消沫剂0.5g，碳酸钙1g。(2)制备二级种子取一级种子按照8％接种量接种于二级种子培养基中，在pH为6.5、27℃培养50h。二级种子培养基：玉米浆16g，豆油40mL，葡萄糖6g，消沫剂0.5g，碳酸钙4g，硫酸钙5g，花生粉4g，黄豆粉4g。(3)发酵取二级种子按照18％接种量接种于发酵培养基中，培养130h，0～40h28℃，40～130h24℃，pH为5.6。发酵培养基：玉米浆50g，豆油55mL，葡萄糖8g，水解淀粉26g，甲硫氨酸4g，花生粉15g，消沫剂2mL，碳酸钙6g，硫酸镁4g，硫酸铵13g，硫酸亚铁0.09g，硫酸锰0.03g，硫酸锌0.025g，硫酸铜0.025g。培养期间，发酵罐进行补料：在以下时间段内补入葡萄糖溶液(葡萄糖的浓度为600-700g//L)和植物油，工艺如下：葡萄糖溶液：40～80h连续流加4～11g/L·h；80～130h连续流加9～21g/L·h；植物油：50～90h连续流加1～6g/L·h；90～130h连续流加3～8g/L·h。整个发酵过程不补水。2、实验结果发酵结束后，取发酵罐发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测:取1g发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，分别检测效价。色谱条件如下：色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1mL/min，进样量：20uL。放罐总十亿为头孢菌素C的产量单位。发酵罐容积为500m3。放罐总十亿的计算方式为：十亿＝效价(μg/mL)*体积(m3)/1000发酵实验结果见表7：表7发酵实验结果补水时间(h)补水量放罐总十亿DOCPC组分(％)002580.51.11将本发明方法(实施例1～6)及现有方法(对比例1)的参数及发酵结果进行归纳，见表8。表8发酵结果比较由表8可以看出：与现有方法相比，使用本发明方法发酵头孢菌素C时，可使头孢菌素C的单罐产量提高4.42％以上，DOCPC杂质含量降低16.22％以上，在提高头孢菌素C产量的同时，大大降低了杂质含量。在优选范围内(实施例2～4记载的工艺范围)，单罐头孢菌素C的产量可提高6.48％以上，DOCPC杂质含量降低20.72％以上；在最佳工艺参数下(实施例3的工艺参数)，单罐头孢菌素C的产量可提高10.89％，DOCPC杂质含量降低41.44％，显著降低生产成本，经济效益显著。综上，本发明方法通过特定的发酵方法，可同时达到头孢菌素C单罐批产量提高、DOCPC杂质含量显著降低的技术效果，大幅度降低生产成本，具有非常良好的工业应用前景。当前第1页1 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