一种提高植物基础抗逆的方法及其应用与流程

本发明属于植物抗逆领域，特别涉及一种提高植物基础抗逆的方法及其应用。

背景技术：

随着气候变暖和温室效应日益严重，植物和作物正面临着越来越多的环境胁迫，如干旱、水淹、高温、盐胁迫等，环境胁迫已成为限制作物产量的重要影响因素之一。

活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是氧分子在还原反应中产生的中间产物。其中，H₂O₂是ROS最重要的成员，其它形式的ROS都可以转化为H₂O₂，H₂O₂能够轻易地透过细胞膜和质膜，使其能在细胞内和细胞间自由流动。一方面，ROS对DNA、蛋白质、不饱和脂等大分子有明显的破坏作用，从而使蛋白质降解，膜脂过氧化，DNA断裂；另一方面ROS还作为一个重要的信号分子，参与调控植物的生长发育以及各种胁迫反应，如真菌入侵的防御、非生物胁迫的响应、气孔开合的调控和木质素的合成调控等。在植物正常生长中，ROS主要作为线粒体、叶绿体和过氧化物酶体的代谢产物，而在逆境胁迫时，ROS可在细胞质中通过NADPH氧化酶(Respiratory burst oxidase homologue，Rboh)和细胞壁结合的三型过氧化物酶(cell wall bound type III peroxidases)产生。这种在植物抗逆早期迅速产生的ROS被称作为ROS迸发，而这种ROS信号的迸发可以被植物感知并作为警报信号往下游传递，从而启动各种胁迫应答机制。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种提高植物基础抗逆的方法。利用生物技术上调植物体内乙烯响应因子第七亚家族(ethylene response factor VII，ERF-VII)成员的表达量，ERF-VII在植物体内的表达量上调后，植物的基础抗逆增加。本发明涉及ERF-VII成员表达上调后，在各种非生物胁迫下，如干旱、强光、高温、重金属离子胁迫下，植物通过ERF-VII上调活性氧合成关键基因RbohD的表达，并通过活性氧传递逆境信号，使植物更早地感应胁迫，上调相关胁迫响应基因，从而使植物对逆境的耐受性增强。

本发明的另一目的在于提供上述提高植物基础抗逆的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种提高植物基础抗逆的方法，通过使植物的ERF-VII家族基因上调，来提高植物的基础抗逆。

所述的ERF-VII家族基因上调为ERF74基因上调。

所述的ERF-VII家族基因上调为通过转基因技术上调ERF-VII家族基因成员，达到植物的基础抗逆目的。

所述的植物为拟南芥、杨树、桉树或水稻。

进一步的，所述的植物为拟南芥。

一种ERF-VII家族基因上调的植物，通过上述方法获得。

所述的ERF-VII家族基因上调的植物在正常种植，盐碱地和其他难于种植植物的土地种植。

所述的提高植物基础抗逆的方法在提高植物基础抗逆中的应用。

当前在植物抗逆的生理与分子调控研究中，已有很多研究表明逆境可导致H₂O₂的累积，且已发现H₂O₂能作为信号分子传递信号，使植物响应逆境。但对于H₂O₂在逆境中如何被迅速产生，如何作为信号进行传导和如何被消除的分子机制的研究仍十分缺乏。本发明的意义在于提出H₂O₂在逆境早期如何被ERF-VII家族成员调控，迅速迸发并传递信号使植物响应逆境。本发明通过提高ERF-VII家族成员的表达量，提高植物的基础抗逆。

本发明首先通过利用嵌合抑制基因沉默技术(Hiratsu et al.,2004)抑制拟南芥ERF-VII家族成员ERF71～ERF75的转录活性，研究ERF-VII家族在植物体中的功能。研究发现，ERF74dominant repressor(ERF74-DR)转基因植株对强光和干旱胁迫的耐受性大大降低。基于发明人的工作经验，发明人认为这种表型是由于植物体内ROS平衡受到破坏所造成的。通过对拟南芥基因组中ERF-VII家族成员的分析可知，拟南芥基因组中，ERF-VII家族共有5个成员，分别是ERF71～ERF75，基于现今对ERF-VII家族的研究进展，发明人认为在ERF-VII家族中ERF74，ERF75起到主要作用。进而发明人构建了35S::ERF74过表达植株，并从ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)订购到了erf74，erf75的突变体，并对它们进行杂交，最终得到erf74erf75双突变体植株。

将35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75植株进行干旱胁迫处理发现，erf74erf75突变体植株在干旱10天后已严重枯萎，erf74也有轻度枯萎症状，erf75则无明显枯萎症状，而35S::ERF74则长得比野生型更为健康。对以上植株浇水恢复3天后，35S::ERF74，WT，erf75植株表型得到恢复，而erf74erf75突变体植株则有一半的植株不能恢复表型而死亡，其他继续存活的植株也长得比野生型小。虽然大部分erf74突变体植株浇水后并没有死亡，但观察发现其部分叶子因失水而枯萎变黑。

接着对35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75植株进行强光处理并观察表型，研究发现erf74erf75叶片已变为紫黑色，而过表达和野生型植株叶片依然为绿色，对以上植株叶片进行花青素含量测定发现erf75，erf74，erf74erf75植株的花青素含量比野生型上升了5～15倍，这表明erf75，erf74，erf74erf75植株受到不同程度强光胁迫。

为了进一步研究ERF74和ERF75是否在其他未研究的胁迫，如高温和重金属逆境起作用，发明者对35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75的原生质体进行42℃高温处理，在高温处理0S、180S、600S、900S后，加入二乙酸荧光素(fluorescein diacetate，FDA)进行染色，并利用细胞流式仪测定原生质体的存活状况。从流式图中可以发现，35::ERF74过表达原生质体对高温有较高的耐受性，在高温处理900S后依然有50％的细胞存活，而erf74erf75突变体植株对高温的耐受性明显下降，在高温处理180S后就只有37.8％的细胞存活，而到了900S后存活的细胞只剩下20.9％。这表明ERF74和ERF75在高温胁迫的响应中起到重要作用。

发明者也对以上原生质体进行氯化铝处理，利用细胞流式仪测定细胞存活率。研究发现erf74，erf74erf75突变体在氯化铝处理下存活率出现不同程度的下降，35::ERF74过表达原生质体则对氯化铝处理有较高的耐受性。这表明ERF74和ERF75同样在重金属离子胁迫的响应中起到重要作用。

以上逆境处理实验结果表明，在拟南芥中过表达ERF-VII家族成员ERF74能提高植株对干旱、强光、高温和重金属离子的耐受性，而erf75，erf74，erf74erf75植株则对干旱、强光、高温和重金属离子的耐受性减弱。这表明ERF74和ERF75在植物抗逆中起到重要作用。

以下为ERF74和ERF75在植物抗逆中所起作用进行阐述。

运用qRT-PCR和反式激活方法分析ERF71～ERF75在胁迫处理和恢复时表达量的变化。研究发现ERF74和ERF75的表达量均受强光，干旱，高温和氯化铝诱导，表达量均大幅上升，且胁迫结束后，ERF74和ERF75的表达量很快下调到原来水平。而ERF71～ERF73的表达量虽然也会受到某种胁迫的的诱导，但诱导量总体不如ERF74和ERF75明显。ERF74和ERF75在逆境中表达量的上升表明其在植物胁迫中发挥重要作用。

为了研究在水淹，干旱和强光处理下，AtERF74在植物体内定位的变化，将AtERF74转入pEarleyGate101(p35S::AtERF74-GFP)形成融合蛋白。再转入农杆菌C58，侵染烟草叶片。在激光共聚焦显微镜下观察到AtERF74在正常情况下大部分定位在细胞膜中，而在水淹(水淹3h后马上在光共聚焦显微镜下观察)、干旱(转化前10天停止浇水，并持续到观察，共干旱13天)和强光(观察前36h放置300μmol·m^-2·s^-1光强的培养箱中)在处理下，AtERF74将会从细胞膜转移到细胞核中。这表明ERF74在植株正常生长条件下，定位在细胞膜中，不起转录激活作用，而当植物受到胁迫时，瞬间重定位到细胞核中。

对35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体或植株进行高温、ABA、AlCl₃、水淹、干旱和强光处理，并利用6-羧基-2,7-二氯荧光素乙酸乙酯(H₂DCFDA，2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，一种非极性化学物，可自由扩散进入细胞，其被ROS氧化后会生成具有高荧光强度的DCF)对细胞进行染色，然后通过细胞流式仪对细胞体内ROS量进行检测。研究发现，erf75，erf74，erf74erf75原生质体的ROS早期迸发受到不同程度的抑制，而35S::ERF74原生质体早期的ROS迸发则出现得更早更强。这表明ERF74和ERF75对植株抗逆早期的ROS迸发起到不可或缺的作用。

RbohD(NADPH-dependent oxidase D)是植物产生ROS的重要基因，发明者利用qPCR和反式激活方法检测ERF74和ERF75的增加或缺少是否会影响RbohD在逆境条件下的表达量。研究表明，RbohD的表达量受到干旱，强光，水淹，高温和氯化铝胁迫的诱导，且这种诱导在35S::ERF74植株中有所增强，而在erf75，erf74，erf74erf75植株中有不同程度减弱。

此前已有多篇文章报道，ERF转录因子与GCC元件结合(Fujimoto et al.,2000)。通过启动子分析，发现RbohD上游1,709bp有一个GCC元件。发明者利用Gateway系统构建了1.876kb的RbohDpro1-LUC(含有GCC元件)和1.676kb的RbohDpro2-LUC(缺少GCC元件)两个载体并核35S::ERF71-75(ERF71-75-PUGW2)载体共同转入到拟南芥野生型原生质体细胞中。研究表明，ERF71，ERF73，ERF75对RbohD启动子有较弱的激活作用，而ERF74则对RbohD启动子有较强的激活作用。当RbohD启动子失去GCC元件后，ERF74的激活作用下降了60％。

为了获得AtERF74与RbohD结合的直接证据，发明者进行了凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)。ERF74蛋白与RbohD启动子的GCC元件混合后明显出现滞留条带，证实了ERF74与RbohD直接结合。当把GGCGGC序列突变成GGAGGA后，滞留条带消失；加入20倍和100倍不含有生物素标记的RbohD probe后，滞留条带亮度明显减弱，突变实验和竞争实验均表明ERF74与RbohD probe特异结合。综上所述。发明者通过反式激活实验和凝胶迁移实验证实了AtERF74通过GCC元件与RbohD直接结合。

发明者通过qPCR和反式激活检测发现水淹响应基因SUS4、LDH，干旱响应基因RD20，氯化铝响应基因AOX1a，高温响应基因HSP18.2的诱导均依赖于ERF74-Rbohd信号通路，当野生型植株或原生质体细胞经过30分钟的10μM DPI(RbohD抑制剂)预处理后，以上响应基因的诱导均受到抑制，运用rbohd突变体进行相似实验也出现同样的情况。而erf74erf75突变体也因为不能在胁迫中上调RbohD的表达，是逆境响应基因的诱导受到抑制。

另外，在杨树，桉树，水稻等植物中也存在ERF-VII家族，他们的过表达植株也有可预期的基础性抗逆提高的结果。ERF-VII家族基因的过表达植株在杨树，桉树，水稻等植物中也可以通过转基因获得。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

随着气候变暖和温室效应日益严重，环境胁迫已成为限制作物产量的重要影响因素之一。而随着经济的发展，我国可用耕地却越来越少。通过转基因增加树木，农作物的基础抗性则变相增加了树木和作物的产量，降低种植成本，使更多的干旱和重金属污染的土地适合种植树木和植物。对改善空气质量，水土流失，缓解粮食压力有着重要作用。本发明发现了过表达拟南芥ERF-VII家族基因成员AtERF74能显著提高植物基础抗逆性，使植株通过更快迅速地ROS迸发传递信号，激活下游胁迫响应基因，响应环境胁迫。

附图说明

图1是ERF74-DR转基因植株的表型。

图2是35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75在正常生长条件，干旱条件和强光条件的表型。

图3是35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体在热处理和氯化铝处理期间，细胞存活率随时间的变化图。

图4是AtERF74在正常生长条件，水淹，干旱和强光处理下的亚细胞定位图。

图5是35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75植株或原生质体在各种处理下，细胞体内平均ROS量随处理时间变化的曲线图。

图6是35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75植株在不同处理条件下，RbohD表达量变化图。

图7是35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体细胞在不同条件，RbohD基因表达量变化图。

图8是反式激活验证ERF74通过GCC元件与RbohD结合。

图9是凝胶滞留实验验证ERF74通过GCC元件与RbohD结合。

图10是逆境响应基因在不同逆境条件下表达量的变化。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1

将pERF74-ERF74转入PHGEAR载体中。再转入农杆菌C58，侵染拟南芥WT中，T1代潮霉素筛选得到阳性的转基因获得ERF74dominant repressor(ERF74-DR)转基因植株，观察表型，发现56.8％的转基因植株(ERF74-DR)出现叶片发黑现象，见图1(a)。进一步进行干旱(Drought)逆境试验，将ERF74-DR和WT植株正常浇水15天后，停止浇水15天，发现ERF74-DR植株枯死，而WT植株生长还较为正常，见图1(b)。

实施例2

将35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75种子播种后，正常生长。干旱试验为将15天正常生长的植株停止浇水15天后恢复浇水3天并观察表型，结果如图2所示，发现erf74，erf74erf75对干旱耐受性减弱，而35S::ERF74则对干旱耐受性增强。强光(HL)试验为将20天正常生长植株转移到强光条件下生长10天并观察表型。另将同时播种的植株在正常生长条件下生长作为对照。结果如图2所示，erf75，erf74，erf74erf75对强光耐受性减弱，35S::ERF74对强光耐受性增强。

实施例3

将将正常生长20～25天的35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75植株提取原生质体后，进行42度高温(Heat)和0.5mM氯化铝(Al)处理预定时间后，加入FDA进行染色，通过流式细胞仪进行检测原生质体细胞的死活。实验发现，结果如图3所示，35::ERF74过表达植株对高温有较高的耐受性，在高温处理900S后依然有50％的细胞存活，而erf74erf75突变体植株对高温的耐受性明显下降，在高温处理180S后就只有37.8％的细胞存活，而到了900S后存活的细胞只剩下20.9％。而氯化铝处理结果也与高温处理结果相近。

实施例4

为了研究在水淹(Flooding)，干旱和强光处理下，AtERF74在植物体内定位的变化，将AtERF74转入转入pEarleyGate101(p35S::AtERF74-GFP)形成融合蛋白。再转入农杆菌C58，侵染烟草叶片。在激光共聚焦显微镜下观察到AtERF74在正常情况下大部分定位在细胞膜中，而在水淹(水淹3h后马上在光共聚焦显微镜下观察)、干旱(转化前10天停止浇水，并持续到观察，共干旱13天)和强光(观察前36h放置300μmol·m^-2·s^-1光强的培养箱中)在处理下，AtERF74将会从细胞膜转移到细胞核中，结果如图4所示。

实施例5

对35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体或植株进行高温、ABA(脱落酸)、AlCl₃、水淹、干旱和强光处理，并利用6-羧基-2,7-二氯荧光素乙酸乙酯(H₂DCFDA，2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate)对细胞进行染色，然后通过细胞流式仪对细胞体内ROS量进行检测。

首先，对35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体进行20μM ABA处理，结果如图5(b)所示。ABA不算是一种逆境胁迫，只是一种与ROS产生相关的转导信号。在ABA处理原生质体仅7分钟时，35S::ERF74，WT，erf75原生质体就产生非常明显的ROS迸发，而erf74只产生少量ROS迸发，而erf74erf75几乎观察不到有ROS迸发的产生，直到ABA处理15分钟时，才在erf74erf75原生质体中观察到较明显的ROS迸发。而到了ABA处理60分钟时，发现erf74，erf74erf75植株的ROS总量明显高于35S::ERF74和WT植株。

接着对35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体细胞进行了42℃高温处理，结果如图5(a)所示。在高温处理45s时，所有的原生质体细胞均有不同程度的ROS迸发出现，到180s时出现ROS迸发的顶峰。此时，35S::ERF74原生质体细胞的ROS迸发强度明显高于WT。而erf74和erf74erf75原生质体细胞只有较弱的ROS迸发出现。到了420s，所有原生质体细胞的ROS迸发基本消失，并保持平稳。420s后erf74和erf74erf75原生质体细胞内ROS有少量上升，而35S::ERF74原生质体细胞内ROS却有所减少

然后对35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体细胞进行0.5mM氯化铝处理，结果如图5(c)所示。研究发现在氯化铝处理原生质体5～10分钟时，35S::ERF74，WT原生质体细胞就产生非常明显的ROS迸发，而erf74，erf75和erf74erf75原生质体细胞只产生少量ROS迸发。到了氯化铝处理60分钟时，erf74，erf74erf75原生质体细胞的ROS总量远远高于35S::ERF74和WT原生质体细胞。发明者对以上植株进行水淹，干旱，强光试验，结果如图5(d)～(f)所示，也得到相类似的结果。

实施例6

利用qPCR检测ERF74和ERF75的增加或缺少是否会影响RbohD在逆境条件下的表达量。通过提取35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75植株在各处理时间段的叶片RNA，并反转录成cDNA，最后通过qPCR进行分析发现，RbohD的表达量受到干旱，强光和水淹条件的诱导，且这种诱导在35S::ERF74植株中有所增强，而在erf75，erf74，erf74erf75植株中有不同程度减弱，结果如图6所示。

接着将RbohD约1.8kb启动子连到Luciferase报告基因中(pRbohD-LUC)，并将此载体(pRbohD—PUGW35)分别转入35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体细胞中，然后对以上原生质体细胞进行42℃高温处理5分钟，20μM ABA和0.5mM氯化铝处理15分钟，然后检测LUC报告基因的荧光强度，结果如图8所示。研究发现在氯化铝，ABA和高温处理下，pRbohD-LUC报告基因的荧光强度都有所增高，但RbohD在erf74，erf74erf75突变体中的诱导则受到了不同程度的抑制。

实施例7

通过启动子分析，发现RbohD上游1,709bp有一个GCC元件，此前已有多篇文章报道，ERF转录因子与GCC元件结合(Fujimoto et al.,2000)。所以发明者利用Gateway系统构建了1.876kb的RbohDpro1-LUC(含有GCC元件)和1.676kb的RbohDpro2-LUC(缺少GCC元件)两个载体。发明者将这两个载体和35S::ERF71-75(ERF71-75-PUGW2)载体分别转入野生型原生质体细胞中。研究发现，结果如图7所示，ERF71，ERF73，ERF75对RbohD启动子有较弱的激活作用，而ERF74则对RbohD启动子有较强的激活作用。当RbohD启动子失去GCC元件后，ERF74的激活作用下降了60％。

为了获得AtERF74与RbohD结合的直接证据，进行了凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)。首先通过大肠杆菌，原核表达出GST-ERF74融合蛋白。结果如图9所示，凝胶迁移实验表明ERF74蛋白与RbohD启动子的GCC元件混合后明显出现滞留条带，证实了ERF74与RbohD直接结合。而当发明者把GGCGGC序列突变成GGAGGA后，滞留条带消失；加入20倍和100倍不含有生物素标记的RbohD probe后，滞留条带亮度明显减弱，突变实验和竞争实验均表明ERF74与RbohD probe特异结合。

通过qPCR和反式激活检测发现水淹响应基因SUS4、LDH，干旱响应基因RD20，氯化铝响应基因AOX1a，高温响应基因HSP18.2的诱导均依赖于ERF74-Rbohd信号通路，当野生型植株或原生质体细胞经过30分钟的10μM DPI(RbohD抑制剂)预处理后，以上响应基因的诱导均受到抑制，运用rbohd突变体进行相似实验也出现同样的情况。而erf74erf75突变体也因为不能在胁迫中上调RbohD的表达，是逆境响应基因的诱导受到抑制，结果如图10所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。