本发明涉及生物催化技术领域，特别涉及磷脂酶D利用宽泛的底物谱实现磷脂化合物之间的相互转化，实现蛋黄磷脂或大豆磷脂中高含量磷脂化合物向低浓度磷脂化合物的富集。
背景技术：
磷脂酰乙醇胺(PE)又称脑磷脂，有α、β两种异构体，天然 PE 以 α 型居多，由于 PE 具有与磷酸基相连的取代基构成的亲水基团及与脂肪酸链构成的疏水基团的双极性分子结构，常用作药物制剂的乳化剂和脂质体制备的辅料。磷脂酰乙醇胺（PE）是细胞膜的重要组成部分，调节神经细胞的一切代谢活动，影响着神经组织的一系列重要功能：细胞渗透性，髓鞘形成，线粒体运作。研究显示，口服脑磷脂能直接为人脑利用，另神经细胞膜修复，回复神经元的正常代谢。脑磷脂与血液凝固有关。凝血激酶是由脑磷脂和蛋白质组成的，它存在于血小板内，能促使血液凝固，可应用于局部止血。此外，脑磷脂还对神经衰弱、动脉粥样硬化、肝硬化和脂肪性病变等具有一定疗效。脑磷脂还是一种生物乳化剂，应用于食品业和化妆品业中，不同脑磷脂含量额磷脂，其乳化性能也不同，高脑磷脂含量的磷脂适合作W/O体系的乳化剂。并且脑磷脂主要应用于临床医疗、食品加工等方面。对人体生活及健康贡献巨大。
在微生物中，磷酯酰乙醇胺（PE）是通过磷酯酰丝氨酸（PS）的脱羧作用形成的。在动物中，它是通过CDP乙醇胺和1，2-甘油二酯的反应生成的。通过磷酯酶A的作用生成溶血磷酯酰乙醇胺。目前国内外制备磷脂酰乙醇胺（PE）的方法主要是从油脚中直接提取，直接提取步骤复杂，耗时长，且提取出来的磷脂酰乙醇胺（PE）纯度不高。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种磷脂酶D高效催化磷脂酰胆碱（PC）合成磷脂酰乙醇胺（PE）的方法。与直接提取法相比，其反应简单，条件温和，单一磷脂化合物浓度高，更适宜工业化生产。
一种磷脂酶D催化磷脂酰胆碱（PC）合成磷脂酰乙醇胺（PE）的方法其生产方法包括以下步骤：
步骤一，摇瓶发酵产磷脂酶D发酵条件优化；
步骤二，磷脂酶D为分泌蛋白，发酵液离心，取上清；
步骤三，将培养基上清进行浓缩处理，得到相对高浓度的粗酶液；
步骤四，卵磷脂溶于有机相，水系中为粗酶液和乙醇胺及醋酸盐缓冲液；
步骤五，将上述两相催化体系置于30℃震荡反应，高效液相色谱法检测磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱含量。
具体地，步骤一所述摇瓶发酵产磷脂酶D发酵条件优化的方法如下：
出发菌株为链霉菌，初始培养基为GYP培养基，其组成成分为葡萄糖5g/L；蛋白胨，5 g/L；酵母粉5 g/L；K2HPO4，2g/L；MgSO4·7 H2O，0.5 g/L；
在此基础上进行优化：设置碳源种类为葡萄糖，甘油，果糖，蔗糖，可溶性淀粉，每种碳源三个平行，分别收取上清进行酶催化反应，得到最优碳源为葡萄糖。以葡萄糖为碳源，考察不同氮源对产酶影响，分别为酵母粉+蛋白胨（对照）、蛋白胨、酵母粉、鱼粉蛋白胨、聚蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、硫酸铵，酵母粉+蛋白胨+(NH4)2SO4、鱼粉蛋白胨+酵母粉，结果表明鱼粉蛋白胨+酵母粉的复合氮源为最优。以葡萄糖为碳源，鱼粉蛋白胨+酵母粉为氮源，添加10g/L 司班、吐温20、吐温60、吐温80、TritonX-100、SDS、DMSO，结果表明司班，吐温80，吐温60等非离子型表面活性剂可以一定程度促进磷脂酶D的释放，司班最优。在此基础上，添加0g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L Ca2+，结果表明，添加3g/L Ca2+能最大限度促进酶活。在此基础上，考察初始pH对产酶影响，设置初始pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，结果表明初始pH为7.0时最有利于菌体产酶。最终得出优选的发酵培养基为：在GYP培养基基础上，将蛋白胨替换为鱼粉蛋白胨，以鱼粉蛋白胨+酵母粉为复合氮源，再添加10g/L表面活性剂司班，添加3g/L Ca2+，初始pH为7.0。
具体地，步骤二磷脂酶D为分泌蛋白，发酵液离心，取上清。具体为：在优化过后的培养条件下培养链霉菌，收集培养液，12000 rpm离心10min，取上清液，4℃保藏用作酶催化反应。
具体地，步骤三中，浓缩具体方法为：将离心取得的上清液装入圆底烧瓶中，低温浓缩。收取浓缩液，重复装入未浓缩的上清液进行蒸发，重复此步骤。浓缩后4℃保存待用。
具体地，步骤四中，得到的粗酶液经过浓缩后进行催化反应。具体过程为：双相反应体系中，有机相溶解有卵磷脂，水相中，添加适当浓度的粗酶液，乙醇胺以及醋酸盐缓冲液。
具体地，步骤五中，反应温度为30℃，震荡反应中摇床转速200 rpm。高效液相色谱法检测磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）的方法为Agilent 1260高效液相色谱；色谱柱为ZORBAX RX-SIL Columns；流动相以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（85:15:0.45:0.05)为流动相A，以正己烷-异丙醇-流动相A(20:48:32)为流动相B，梯度洗脱；柱温为39℃，用蒸发光散射检测器检测。
有益效果是：
1、本发明针对直接从油脚中分离磷脂酰乙醇胺（PE）时PE含量低，通过本发明可以提高卵磷脂或大豆磷脂中PE的含量。
2、本发明采用两相催化体系，反应结束后，反应生成的另外一种产物胆碱存在于水系中，因此水系中全部为我们不需要的化合物，我们需要的磷脂酰乙醇胺（PE）单独存在于有机相中，因此，在后期分离过程中有助于提高产品纯度，降低分离难度，且本方法的催化活性高，转化率高。
附图说明
图1为本发明的磷脂酶D高效催化磷脂酰胆碱（PC）合成磷脂酰乙醇胺（PE）的反应原理示意图。
具体实施方式
实施例1
磷脂酶D的制备和产酶条件优化，包括以下步骤：
步骤一，摇瓶发酵产磷脂酶D发酵条件优化：出发菌株为穗色链霉菌Streptomyces racemochromogenes ATCC23954，初始培养基为GYP培养基，其组成成分为葡萄糖5g/L；蛋白胨，5 g/L；酵母粉5 g/L；K2HPO4，2g/L；MgSO4·7 H2O，0.5 g/L；将斜面培养基上的孢子以1mL生理盐水悬浮，接种到GYP培养基中，30℃培养；将种子液以1%的接种量接种到发酵产酶培养基（在GYP培养基基础上，将蛋白胨替换为鱼粉蛋白胨，再添加10g/L表面活性剂司班，添加3g/LCa2+，初始pH为7.0）中30℃培养。
步骤二，在优化过后的培养条件下培养链霉菌，收集培养液，12000 rpm离心10min，取上清液，得到的培养基上清于4℃保藏。
步骤三，将离心取得的上清液装入圆底烧瓶中，低温浓缩。收取浓缩液，重复装入未浓缩的上清液进行蒸发，重复此步骤。浓缩后4℃保存待用，用作酶催化反应。
实施例2
磷脂酶D催化磷脂酰胆碱合成磷脂酰乙醇胺，包括以下步骤：
步骤一，催化反应为双向反应体系，有机相溶解有10g/L卵磷脂，水相中，添加适当浓度的粗酶液，乙醇胺以及0.2 M醋酸盐缓冲液（pH=5.5）。
步骤二，将上述两相催化体系置于30℃震荡反应，震荡反应中摇床转速200 rpm。高效液相色谱法检测磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）的方法为Agilent 1260高效液相色谱；色谱柱为ZORBAX RX-SIL Columns；流动相以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（85:15:0.45:0.05)为流动相A，以正己烷-异丙醇-流动相A(20:48:32)为流动相B，梯度洗脱；柱温为39℃，ELSD检测，，反应10h测得最终产率为64.6%。