关于工频电磁辐射的微小RNA剂量标志物的制作方法

本发明涉及一种miRNA的标志物，特别涉及一种可检测工频电磁辐射的miRNA标志物。

背景技术：

microRNA(miRNA)是一类长度约为19-25nt的内源性非编码RNA，广泛参与基因转录后调控活动，具有重要的生命调节功能。细胞间的相互作用可通过释放蛋白质、核酸、脂质等分子到胞外，与受体结合从而介导胞内信号转导。除了这些单分子以外，细胞还可以释放膜囊泡，通过水平转移功能性的mRNA、miRNA和蛋白质到受体细胞，改变细胞的功能。外泌体和微泡就是其中的两种，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。

有研究显示，10Hz极低频电磁场可以诱导膜损伤，致钙离子内流，相应地增加了微泡的释放。旁效应可通过受照射的细胞与未照射细胞间的相互作用而诱导，而调节这种通信的信号分子可以是细胞因子、氧自由基、NO甚至是miRNA。由受照射的细胞培养基提取的外泌体可能会诱导旁效应，而miR-21，作为已知的参与DNA损伤的microRNA，受外泌体调控，在受照后表达上调，沉默miR-21后，旁效应明显减弱，以上结果充分显示外泌体携带的miRNA在射线诱导的旁效应中起到非常大的作用。

当电磁场强度超过人体可接受的极限值时,电磁场的短时间和长时间作用都对人体产生现实的危害性。目前没有能及时监测的指标。现阶段，还没有关于工频电磁场引起机体miRNA变化的相关研究。

技术实现要素：

本发明的目的就是寻找机体受极低频电磁场照射后的时间和剂量标志物，早期发现受损伤人群，提早防护或治疗，并弥补现有技术的不足。

本发明所采取的技术方案是：

1)将实验动物置于辐射环境中；

2)抽取实验动物血液，提取RNA；

3)检测RNA中工频miRNA标志物的含量，根据miRNA标志物的含量确定工频电磁辐射情况。

优选的，所述实验动物为小鼠。

优选的，所述工频miRNA标志物为一种工频电磁辐射照射时间的miRNA标志物的组合，由mmu-miR-200a-3p，mmu-miR-374b-5p中的至少一种组成。

优选的，所述工频miRNA标志物为一种工频电磁辐射的照射剂量miRNA标志物：

1)0.1mT照射剂量的标志物为：mmu-miR-151-3p，mmu-miR-152-3p，mmu-miR-15b-3p，mmu-miR-181d-5p，mmu-miR-204-3p，mmu-miR-215-3p，mmu-miR-223-5p，mmu-miR-3969，mmu-miR-431-5p，mmu-miR-451a，mmu-miR-93-5p中的至少一种；

2)0.5mT照射剂量的标志物为：mmu-miR-133a-3p，mmu-miR-335-5p，mmu-miR-455-5p中的至少一种；

3)2.5mT照射剂量的标志物为：mmu-miR-142a-5p，mmu-miR-30b-5p，mmu-miR-374c-3p，mmu-miR-410-3p，mmu-miR-652-3p中的至少一种。

本发明提供的工频电磁辐射检测方法，具有准确度高，灵敏度好，应用简便的特点。

附图说明

图1电镜下血清外泌体形状及粒径。

图2剂量组别microRNA集合图；相关图注：0.5mT和0.1mT共有的microRNA0.1mT剂量组和2.5mT剂量组共有的microRNA2.5mT剂量组，0.1mT剂量组和0mT剂量组共有的microRNA0.1mT剂量组和0mT剂量组共有的microRNA0.5mT剂量组，0.1mT剂量组和0mT剂量组共有的microRNA四个剂量组共有的microRNA0.5mT和2.5mT共有的microRNA0.5mT剂量组，2.5mT剂量组和0mT剂量组共有的microRNA0.5mT和0.1mT共有的microRNA2.5mT剂量组和0mT剂量组共有的microRNA只存在于0mT剂量组的microRNA。

图3时间组别microRNA集合图：相关图注：只在存在于第10天的microRNA第10天和第90天共有的microRNA只在存在于第90天的microRNA第10天和第30天共有的microRNA第10天，第30天和第90天共有的microRNA第30天和第90天共有的microRNA只在存在于第30天的microRNA。

具体实施方式

实施例1.动物和工频电磁场照射

本实验采用了初始年龄为4-6周的雄性Balb/c小鼠，共130只。随机分为13组，每组10只。本实验共有0,0.1,0.5,2.5mT四个剂量，每个剂量按照射天数10天，30天，90天分为3组，每组每天照射8小时，照射期满后取样。初始未照射组作为对照组进行比较。

实施例2.血清的收集：

采用眼球后静脉丛取血法对每只小鼠进行取血。每只小鼠约获得800-1200ul外周血。样品于4℃冰箱中静置4-5小时后，4000rpm，4℃，离心15分钟。每个样品均吸取200ul的上清液，并汇总各组的10个样品，收集于灭菌过的离心管中，共2ml。超速离心法提取外泌体。

实施例3.外泌体形状分析

1)纳米颗粒跟踪分析技术鉴定提取外泌体的粒径大小及分布

纳米颗粒在其悬浊液中受到周边溶液分子的撞击而做无规则的布朗运动，然后通过斯托克斯-爱因斯坦方程，这些颗粒在单位时间内的移动速度与其本身的粒度、溶液的粘度和温度存在数量上的关系。因此通过观察溶液中的颗粒运动轨迹，得出与之相关的颗粒粒径数据。同时，通过仪器内置的高速相机和软件，对观察到的每一个颗粒进行跟踪分析，最终提供与常规粒度仪所不同的粒径数量分布以及颗粒物浓度的分析结果。

2)透射电子显微镜观察外泌体形态和大小

3)Western Blotting方法鉴定外泌体膜表面标志物TSG101，CD63

实施例4.Micro RNA深度测序和生物信息学分析

对于small RNA测序实验，从总RNA到最终的cDNA文库制备完成主要包括以下步骤：用电泳切胶法获取长度范围在18～30nt左右的RNA片段；片段进行末端修复并在其两端分别连接5’-adapter和3’-adapter；随后扩增，得到最终的cDNA文库；DNA文库上机测序。

实施例5.信息分析流程

Illumina HiSeqTM 2500测序所得51nt序列(Reads)集，通过去掉Reads两端的接头、去掉低质量Reads、去污染等过程完成数据初步过滤，得到干净序列，对其进行序列长度分布的统计及样本间公共序列统计。将清理之后的干净序列进行分类注释，可以获得样本中各组分及表达量信息。将所有小RNA片段注释后，用剩下的未注释片段进行新miRNA的预测。

结果如图2和图3所示：1)图2表示的是剂量组别microRNA集合图，四个椭圆分别代表0、0.1、0.5、2.5mT剂量组所包含的microRNA，数字代表所在独立空间的microRNA数量，百分数字代表该区域microRNA占总体的百分比，如图中所示13代表仅存在于0.1mT组的microRNA数量为13，占总体数量的20％；2)图3表示时间组别microRNA集合图：三个圆形分别代表第10、30、90天所包含的microRNA，数字代表所在独立空间的microRNA数量，百分数字代表该区域microRNA占总体的百分比，如图中所示12代表仅存在于第10天的microRNA数量为12，占总体数量的32.4％。