一种大量提取质粒的方法及其应用与流程

文档序号:12248932阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种大量提取质粒的方法,其特征在于使用了新型的核酸染料。

2.根据权利要求1所述的一种大量提取质粒的方法,其特征在于所述使用的新型核酸染料为GoldenView。

3.根据权利要求1所述的一种大量提取质粒的方法,其特征在于包括:P1缓冲液、P2缓冲液、P3溶液,其组分如下:

P1缓冲液:25-70mmol/L Tris-HCl,5-30mmol/L EDTA,100ug/mL Rnase A,pH=7.0-8.5;

P2缓冲液:100-350mmol/L NaOH,0.1-3%SDS;

P3溶液:1-6mol/L KAc,pH=4.0-5.5。

4.根据权利要求1所述的一种大量提取质粒的方法,其特征在于包括如下步骤:

步骤1,质粒的制备。将含有目的质粒的大肠杆菌接种至400mL TB培养基中,37℃,200rpm培养过夜。然后4℃,6000g离心10min,弃上清,倒置离心管使残余的液体流出。加入预冷至4℃的P1缓冲液至终体积到10mL,震荡重悬使沉淀的细菌均匀分散,然后加入20mg固体溶菌酶(hen egg white lysozyme),完全重悬沉淀,室温放置10min;再加入20mL新鲜制备的P2溶液,用移液管轻轻混匀直至溶液均一透明,室温放置5-10min;最后加入预冷至4℃的P3溶液10mL,轻轻但完全地震荡混匀数次,直至两个液相不再分离,原有的黄色消失,白色絮状物出现,然后置于冰上10min。4℃,8000rpm离心10min,弃沉淀,将上清通过四层纱布过滤到量筒中,然后加入0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温放置10-15min,置于50mL离心管中,再8000rpm离心15min后,将上清弃处干净,回收核酸沉淀。

步骤2,质粒的纯化。洗涤核酸沉淀:在室温下,用2mL 70%乙醇涮洗管底及管壁。然后将乙醇倒出,并吸干管壁上的液滴;或8000rpm,常温离心10min,弃上清。敞开离心管管口10-15min,使剩余的乙醇完全挥发掉。接着加入7mL 1×TE溶液溶解沉淀,并加入7mL该溶液冲洗管壁。加入氯化铯12.5g,溶解混匀后加入GoldenView核酸染料10微升后混匀。转移上述溶液至超速离心管中,充满离心管并平衡密封。室温下55000rpm离心至少12h,或65000rpm离心4h。离心结束后,将离心管取出,置于锡箔纸包裹的试管架上,在仅有微光的室内,可见两条DNA区带,上层区带是染色体和线性DNA,下层为所需的cccDNA。用18号针管,小心收集cccDNA,置于50mL离心管中。加入等体积的水饱和异戊醇,盖紧管盖,震荡混合有机相和水相。室温下450g离心3min,使水相和有机相分离,并将上层有机相(粉红色)转移至合适的废液桶中。重复抽提上述三个步骤4-6次,直到水相和有机相均不见绿色。加入2.2倍体积的水,0.6倍体积的异丙醇,混匀。室温下,8000rpm离心15min,完全弃上清,并回收核酸沉淀。加入8mL超纯水重悬沉淀,再加入10mol/L醋酸铵溶液至终浓度2mol/L,充分混匀后加入2.5-3倍体积,预冷至-20℃的乙醇(-20℃),混匀,置于干冰或-80℃冰箱中,孵育10min。4℃,8000rpm离心10min,弃上清。加入20mL 70%乙醇,混合,4℃,12000g离心10min,弃上清,最后将离心管置于超净台中风干2min,加入TE溶解质粒。

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