西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶、其编码基因及应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶、其编码基因及应用。

背景技术：

八氢番茄红素合成酶((phytoene shythase，CrtB，PSY)是八氢番茄红素及其它类胡萝卜素等萜类化合物合成的关键酶。牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS)可催化15碳的法呢基焦磷酸(FPP)和5碳的异戊烯基焦磷酸(IPP)缩合生成20碳的牻牛儿基牻牛儿焦磷酸(GGPP)，GGPP是萜类及其类胡萝卜素生物合成的关键前体物质。牻牛儿基牻牛儿焦磷酸(GGPP)在八氢番茄红素合成酶(CrtB，PSY)的作用下可以合成八氢番茄红素，可参考图1。

目前对于西红花中是否具有八氢番茄红素合成酶以及西红花中八氢番茄红素合成酶的功能验证目前专利文献中并没有发现。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶、其编码基因及应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶基因，其开放阅读框序列如下：

(a)：如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

(b)：由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经过替换、缺失或添加一个或多个碱基而得到的具有八氢番茄红素合成功能的序列。

对于(a)而言，西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶基因序列全长为1501bp，序列包括176bp 5’端非编码区、1218bp开放阅读框和61bp 3’端非编码区，556bp 处存在一个46bp的内含子。此基因编码405个氨基酸，该基因DNA序列具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。该基因的cDNA全长序列具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

其中西红花内生真菌生物学名称为Cadophora luteo-olivacea.，其指定名称为3P1CQ1，目前保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.11606，保藏日期为：2015年11月24日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

该西红花内生真菌的培养及保存条件为平板保存，培养基条件为：土豆200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾5g，无水硫酸镁1.46g，VB1：10mg，琼脂18g，加单蒸水至1L。

一种西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶，其由西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶基因编码而成，其是如下的蛋白质(a)或蛋白质(b)：

蛋白质(a)：具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质；

蛋白质(b)：由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有八氢番茄红素合成功能的蛋白质。

本发明还提供了西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶基因的功能验证。通过构建表达载体，经颜色遗传互补反应，证明该基因表达蛋白具有酶催化活性。因此，本发明的西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶基因在细菌、真菌、藻类和高等植物中通过基因工程的手段参与合成萜类化合物，所述的萜类化合物包括八氢番茄红素或类胡萝卜素。

八氢番茄红素合成酶用于催化萜类化合物合成，所述的萜类化合物包括八氢番茄红素或类胡萝卜素，具体的，八氢番茄红素合成酶用于催化2分子的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成八氢番茄红素(C₄₀H₆₄)。

本发明的具体技术方案如下：

一、西红花内生真菌基因组DNA的提取：将西红花内生真菌3P1CQ1从PDA平板上转接入100mL发酵培养基，在摇床上以120rpm/min黑暗培养7天，作为真菌发酵液。实施步骤：(1)材料的制备：将真菌发酵液放于50mL离心管内，4000rpm离心10min，倒去上清液。用蒸馏水清洗菌体离心。将离心后的菌体沉淀至于研钵中，倒入液氮，充分研磨至粉末状。提前称量50mL离心管重，将研磨粉末小心倒入50mL离心管中，室温放置1-2min，称量并计算样品重量。(2)称取1g菌体加入5mL 2％经65℃预热的CTAB，充分混匀，加入10μL巯基乙醇 防止溶液中的酚类物质氧化。将其置于65℃水浴1h，期间每隔5min混匀一次，取出后放置于室温。(3)加入5mL的酚/氯仿/异戊醇25:24:1，充分颠倒混合至少15min，将提取液中的蛋白质杂质变性，分装至1.5mL离心管内，室温下4℃12000rpm，离心10min。(4)将所有上清液转移至新EP管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，充分颠倒混合抽提提取液中含有蛋白质，并萃取出酚类物质，室温下12000rpm离心20min。(5)将步骤(4)重复2次。(6)将上清液移至新的EP管中，向上清液中加入1倍体积的异丙醇和1/10体积的醋酸钠(NaAc pH5.2)，充分颠倒混匀使DNA从溶液中析出，形成絮状沉淀，冰上静置1h，4℃，12000rpm离心20min。(7)弃上清，加入500μL经由4℃预冷70％无水乙醇，颠倒混匀，小心将沉淀重悬，4℃，12000rpm离心5min。(8)将步骤⑹重复2次。(9)弃上清，将剩余液体尽量吸净，放置于超净台中吹干。(10)加入约50μL TE缓冲液，充分溶解DNA，溶解后置于-20℃冰箱保存。

西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶基因保守序列的克隆：通过基因保守序列设计引物。PCR反应条件：94℃变性5min；94℃45s，57.3℃30s，72℃2min，进行34个循环；72℃延伸5min。放置于4℃保温。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收该电泳中的目的条带。

西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶基因保守序列连接转化：将八氢番茄红素合成酶基因保守片段与载体pMD19-T连接，并转化DH5α大肠杆菌，通过菌落PCR验证转化结果。实施步骤：(1)连接反应体系：pMD19-T载体(0.5μL)，目的DNA(2μL)，Solution I(5μL)，ddH₂O(2.5μL)，总计10μL。(2)将以上反应液在PCR仪中16℃保温4小时。(3)将感受态细胞DH5α冰上融化，取出100μL感受态细胞与10μL DNA连接液混合，冰上放置30min。(4)42℃精确加热45s，迅速放置于冰上冰浴2min。(5)在EP管中加入1mL LB培养基，37℃震荡培养1小时，至菌体复活。(6)4000rpm离心10min，去掉800μL上清液，将剩余菌液涂布于含有抗生素的LB固体培养基上，37℃过夜培养12小时。(7)用无菌牙签挑取菌落进行鉴定。将连接转化成功的菌液送到上海生工生物股份有限公司进行测序。

西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶基因cDNA序列克隆：参照CLONTECH公司SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit方法进行克隆。

首先，西红花内生真菌RNA提取：将西红花内生真菌3P1CQ1从PDA平板 上转接入100mL发酵培养基，在摇床上以120rpm/min黑暗培养7天，作为提取材料。实施步骤：(1)将菌液放入大离心管5000rpm离心10min，弃去上清液，再用蒸馏水重悬菌体，再次5000rpm离心10min。(2)将RNA样品放入研钵中，用研杵研磨，不断加入液氮至粉末状，待液氮挥发后加入1mL RNA裂解液和10μLβ-巯基乙醇。(3)待溶化后，将裂解液转移至1.5mL离心管中，室温静置5min，12000rpm 4℃离心5min，并取上清液放入新的EP管中。(4)向裂解液中加入200μL氯仿，剧烈震荡15-30s，充分乳化后静置5min 12000rpm 4℃离心15min。(5)此时匀浆三层，无色上清/白色蛋白层/有色有机相，取上清转移至另一EP管中(重复4、5步2-3次)。(6)在上EP管中加入异丙醇250μL，5M NaCl溶液250μL，上下颠倒使充分混匀，室温下静置30min。(7)12000rpm离心10min，弃去上清。(8)缓慢沿管壁加入75％乙醇1mL，上下颠倒，使沉淀重悬。(9)12000rpm离心5min后弃去乙醇(重复8、9步1-2次)，再用1mL无水乙醇重悬，小心弃去乙醇。(10)置于超净台，室温干燥10min，加入50μL不含RNase水溶解。

其次，3'RACE cDNA和5'RACE cDNA制备，实施步骤：

(1)将混合液【5'RACE反应液：总RNA 3μL，5'CDS Primer(5'–(T)₂₅V N–3')1μL，dNTPMix 4μL，RNase free H₂O 1μL，SMART ⅡA oligo(5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3')1μL，总计10μL；3'RACE反应液：总RNA 3μL，3'CDS Primer(5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)₃₀V N–3')1μL，dNTPMix 4μL，RNase free H₂O 2μL，总计10μL。N代表A,C,G,或T；V代表A,G,或C)于PCR仪中65℃保温5min后迅速冰上急冷2min以上。(2)离心数秒使模板RNA和引物的混合液聚于管底。(3)配置反转录反应液【模板RNA 10μL，5×Primescript Buffer 4μL，RNase Inhibitor 0.5μL，RNase free H₂O 5μL】于PCR仪中42℃保温60min。(4)70℃保温15min后于冰上冷却。反转录后的cDNA置于-20℃冰箱保存。

再次，西红花内生真菌cDNA的3'端和5'端克隆：分别以上述反转录获得的西红花内生真菌3'RACE cDNA和5'RACE cDNA为模板，使用通用引物UPM和特异性引物PGSP克隆西红花内生真菌cDNA的3'端和5'端。实施步骤如下：

(1)3'RACE PCR反应实施步骤：在反应体系为【模板(3'RACE cDNA)1μL，引物UPM Long(GTATCAACGCAGAGT–3')0.5μL，引物UPM Short(5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3')0.5μL，引物PGSP1 (5'–CCTGCTCTACGACTTCTCCCGATTCA–3')0.5μL，ddH₂O 12.5μL，TaqMix10μL，总计25μL】中进行。3'RACE反应条件：使用Touchdown PCR 94℃变性5min；94℃30s，72℃3min反应5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃3min反应5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min反应27个循环；72℃延伸5min。

3'RACE反应产物琼脂糖凝胶切胶回收，连接到pMD19-T载体上后转化进大肠杆菌DH5α,送测序。

(2)5'RACE PCR反应实施步骤如下：

(2.1)5'RACE第一轮PCR：在反应体系【模板(5‘RACE cDNA)0.5μL，引物UPM Long0.5μL，引物UPM Short0.5μL，引物PGSP2(5'–CATACCGCAACGACTCCAGCAGAGCGCG–3')0.5μL，ddH₂O 13μL，TaqMix10μL，总计25μL】中进行。TouchdownPCR反应条件：94℃预变性3min；94℃40s，72℃30s，72℃1.5min反应5个循环；94℃40s，70℃30s，72℃3min反应5个循环94℃40s，68℃30s，72℃3min反应35个循环；72℃延伸5min。

(2.2)5'RACE第二轮PCR：将第一轮PCR反应稀释50倍(1st PCR×50)作为第二轮反应的模板。在反应体系【模板(1st PCR×50)0.5μL，引物UPM Long0.5μL，引物UPM Short0.5μL，引物PGSP3(5'–GAACTATGCTTGGAACTGGTCTTT–3')0.5μL，ddH₂O13μL，TaqMix10μL，总计25μL】中进行。Touchdown PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃40s，68℃30s，72℃1.5min反应5个循环；94℃40s，65℃30s，72℃3min反应5个循环；94℃40s，62℃30s，72℃3min反应35个循环；72℃延伸5min。将上述3'RACE和5'RACE反应产物切胶回收，连接到pMD19-T测序。测序所得结果进行生物信息学分析。

高保真酶KOD克隆八氢番茄红素合成酶基因DNA和cDNA序列：使用高保真酶KOD在反应体系【模板(DNA或cDNA 1μL，引物PSYT1(5’-CCATTTGCTCTCCTACTCTGGTCACT-3’)0.75μL，引物PSYT2(5’-TGGTGCTCTGGCATCGACTGGTAAT-3’)0.75μL，10×Buffer 5μL，dNTP5μL，MgSO₄ 3μL，ddH₂O33.5μL，高保真酶KOD1μL，总计50μL】中进行。PCR反应条件(两步法)：94℃预变性2min；98℃10s，68℃1min进行35个循环；72℃延伸5min。PCR反应产物1％琼脂糖凝胶电泳。

PCR产物3'末端加A反应：将高保真酶KOD克隆的PCR产物切胶回收，将回收的DNA用Elution Buffer溶解，通过反应液加A反应：模板(胶回收DNA)10μL，10×PCR Buffer2μL，dNTP 3μL，TaqMix 0.25μL，ddH₂O4.75μL，总计20μL。PCR仪中72℃保温30min。将产物连接pMD19-T载体转化大肠杆菌DH5α，送生工生物有限公司测序。

八氢番茄红素酶基因功能验证：通过PCR反应体系【模板(cDNA)1μL，引物cPSY1(5’-TTGAATTCCATGGTAGACACTTTAGCCTTG-3')0.75μL，引物cPSY2(5’-CCCTCGAGTTCCTGGTTACCCAGCATTCAA-3')0.75μL，10×Buffer 5μL，dNTP5μL，MgSO43μL，ddH₂O 33.5μL，高保真酶KOD 1μL】，在PCR反应条件：94℃预变性2min；98℃10s，60℃30s，68℃1min进行35个循环；72℃延伸5min下克隆八氢番茄红素cDNA。将克隆产物进行3’端加A反应，与pMD19-T载体连接，转化至XL1-Blue感受态细胞，培养获得单克隆，抽提质粒经EcoR I与Xho I双酶切。同样，pET32a表达载体经克隆和质粒抽提，EcoR I与Xho I双酶切。双酶切反应体系：EcoR I(10U/μL)0.5μL，Xho I(10U/μL)0.5μL，重组质粒20μL，10×H Buffer5μL，ddH₂O 24μL，总计50μL。pACCAR25ΔcrtB质粒的XL1-Blue。双酶切产物经电泳切胶回收pET32a和八氢番茄红素合成酶基因片段。

将八氢番茄红素合成酶基因片段8μL和pET32a骨架1μL混合，45℃加热5min以使重新退火的粘端解链，将混合物放置在冰上冷却到0℃。在以上混合液中加入10×T4DNA ligase buffer 2.5μL，T4DNA ligase 1μL，ddH₂O 12.5μL总计25μL。在16℃过夜连接获得pET32a-crtB质粒。

将pET32a-crtB质粒转化进携带有pACCAR25ΔcrtB(含有crtE、crtI、crtX、crtY、crtZ，但是缺少crtB八氢番茄红素合成酶基因)质粒的XL1-Blue的感受态细胞中。经颜色互补反应验证八氢番茄红素基因的功能：在LB双抗平板上：(1)XLI-Blue细菌，由于不带有抗性基因，所以不能生长；(2)携带pET32a-crtB质粒的XLI-Blue细菌，含有Cm抗性基因，但没有Amp抗性基因，所以也不能生长；(3)只携带PACCAR25△crtB质粒的XLI-Blue细菌，含有Amp抗性基因，但没有Cm抗性基因，所以也不能生长；(4)携带pET32a和pACCAR25△crtB质粒的XLI-Blue细菌，含有Cm和Amp抗性基因，所以能生长，但没有PSY基因，不能合成玉米黄素，菌落呈白色；(5)携带pET32a-crtB和pACCAR25△crtB双质粒的细菌，既能在LB双抗平板生长，又能合成玉米黄素，显示出黄色的菌落。实验表 明所克隆的八氢番茄红素合成酶基因crtB编码的蛋白具有催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸GGPP合成八氢番茄红素的功能。

附图说明

图1为八氢番茄红素合成技术路线图；

图2为大肠杆菌XL1-Blue细胞中通过颜色互补验证八氢番茄红素合成酶基因crtB功能结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶基因，其开放阅读框序列如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶基因的cDNA全长序列具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，序列全长为1501bp，序列包括176bp 5’端非编码区、1218bp开放阅读框和61bp 3’端非编码区，556bp处存在一个46bp的内含子。此基因编码405个氨基酸。

其中西红花内生真菌生物学名称为Cadophora luteo-olivacea.，其指定名称为3P1CQ1，目前保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.11606，保藏日期为：2015年11月24日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

该西红花内生真菌的培养及保存条件为平板保存，培养基条件为：土豆200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾5g，无水硫酸镁1.46g，VB1：10mg，琼脂18g，加单蒸水至1L。

西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶，其由西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶基因编码而成，其是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

本发明的实施方式还提供了西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶基因的功能验证。通过构建表达载体，经颜色遗传互补反应，证明该基因表达蛋白具有酶催化活性，可催化2分子的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸GGPP合成八氢番茄红素(C₄₀H₆₄)。

本发明的实施方式的具体技术方案如下：

一、西红花内生真菌基因组DNA的提取：将西红花内生真菌3P1CQ1从PDA平板上转接入100mL发酵培养基，在摇床上以120rpm/min黑暗培养7天，作为真菌发酵液。实施步骤：(1)材料的制备：将真菌发酵液放于50mL离心管内， 4000rpm离心10min，倒去上清液。用蒸馏水清洗菌体离心。将离心后的菌体沉淀至于研钵中，倒入液氮，充分研磨至粉末状。提前称量50mL离心管重，将研磨粉末小心倒入50mL离心管中，室温放置1-2min，称量并计算样品重量。(2)称取1g菌体加入5mL 2％经65℃预热的CTAB，充分混匀，加入10μL巯基乙醇防止溶液中的酚类物质氧化。将其置于65℃水浴1h，期间每隔5min混匀一次，取出后放置于室温。(3)加入5mL的酚/氯仿/异戊醇25:24:1，充分颠倒混合至少15min，将提取液中的蛋白质杂质变性，分装至1.5mL离心管内，室温下4℃12000rpm，离心10min。(4)将所有上清液转移至新EP管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，充分颠倒混合抽提提取液中含有蛋白质，并萃取出酚类物质，室温下12000rpm离心20min。(5)将步骤(4)重复2次。(6)将上清液移至新的EP管中，向上清液中加入1倍体积的异丙醇和1/10体积的醋酸钠(NaAc pH5.2)，充分颠倒混匀使DNA从溶液中析出，形成絮状沉淀，冰上静置1h，4℃，12000rpm离心20min。(7)弃上清，加入500μL经由4℃预冷70％无水乙醇，颠倒混匀，小心将沉淀重悬，4℃，12000rpm离心5min。(8)将步骤(6)重复2次。(9)弃上清，将剩余液体尽量吸净，放置于超净台中吹干。(10)加入约50μL TE缓冲液，充分溶解DNA，溶解后置于-20℃冰箱保存。

西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶基因保守序列的克隆:1通过基因保守序列设计引物。PCR反应条件：94℃变性5min；94℃45s，57.3℃30s，72℃2min，进行34个循环；72℃延伸5min。放置于4℃保温。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收该电泳中的目的条带。

西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶基因保守序列连接转化：将八氢番茄红素合成酶基因保守片段与载体pMD19-T连接，并转化DH5α大肠杆菌，通过菌落PCR验证转化结果。实施步骤：(1)连接反应体系：pMD19-T载体(0.5μL)，目的DNA(2μL)，Solution I(5μL)，ddH₂O(2.5μL)，总计10μL。(2)将以上反应液在PCR仪中16℃保温4小时。(3)将感受态细胞DH5α冰上融化，取出100μL感受态细胞与10μL DNA连接液混合，冰上放置30min。(4)42℃精确加热45s，迅速放置于冰上冰浴2min。(5)在EP管中加入1mL LB培养基，37℃震荡培养1小时，至菌体复活。(6)4000rpm离心10min，去掉800μL上清液，将剩余菌液涂布于含有抗生素的LB固体培养基上，37℃过夜培养12小时。(7)用无菌牙签挑取菌落进行鉴定。将连接转化成功的菌液送到上海生工生物股份有限公司进行测 序。

西红花内生真菌八氢番茄红素合成酶基因cDNA序列克隆：参照CLONTECH公司SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit方法进行克隆。

首先，西红花内生真菌RNA提取：将西红花内生真菌3P1CQ1从PDA平板上转接入100mL发酵培养基，在摇床上以120rpm/min黑暗培养7天，作为提取材料。实施步骤：(1)将菌液放入大离心管5000rpm离心10min，弃去上清液，再用蒸馏水重悬菌体，再次5000rpm离心10min。(2)将RNA样品放入研钵中，用研杵研磨，不断加入液氮至粉末状，待液氮挥发后加入1mL RNA裂解液和10μLβ-巯基乙醇。(3)待溶化后，将裂解液转移至1.5mL离心管中，室温静置5min，12000rpm 4℃离心5min，并取上清液放入新的EP管中。(4)向裂解液中加入200μL氯仿，剧烈震荡15-30s，充分乳化后静置5min 12000rpm 4℃离心15min。(5)此时匀浆三层，无色上清/白色蛋白层/有色有机相，取上清转移至另一EP管中(重复4、5步2-3次)。(6)在上EP管中加入异丙醇250μL，5M NaCl溶液250μL，上下颠倒使充分混匀，室温下静置30min。(7)12000rpm离心10min，弃去上清。(8)缓慢沿管壁加入75％乙醇1mL，上下颠倒，使沉淀重悬。(9)12000rpm离心5min后弃去乙醇(重复8、9步1-2次)，再用1mL无水乙醇重悬，小心弃去乙醇。(10)置于超净台，室温干燥10min，加入50μL不含RNase水溶解。

其次，3'RACE cDNA和5'RACE cDNA制备，实施步骤：

(1)将混合液【5'RACE反应液：总RNA 3μL，5'CDS Primer(5'–(T)₂₅V N–3')1μL，dNTPMix 4μL，RNase free H₂O 1μL，SMART ⅡA oligo(5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3')1μL，总计10μL；3'RACE反应液：总RNA 3μL，3'CDS Primer(5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)₃₀V N–3')1μL，dNTPMix 4μL，RNase free H₂O 2μL，总计10μL。N代表A,C,G,或T；V代表A,G,或C)于PCR仪中65℃保温5min后迅速冰上急冷2min以上。(2)离心数秒使模板RNA和引物的混合液聚于管底。(3)配置反转录反应液【模板RNA 10μL，5×Primescript Buffer 4μL，RNase Inhibitor 0.5μL，RNase free H₂O 5μL】于PCR仪中42℃保温60min。(4)70℃保温15min后于冰上冷却。反转录后的cDNA置于-20℃冰箱保存。

再次，西红花内生真菌cDNA的3'端和5'端克隆：分别以上述反转录获得的西红花内生真菌3'RACE cDNA和5'RACE cDNA为模板，使用通用引物UPM和特 异性引物PGSP克隆西红花内生真菌cDNA的3'端和5'端。实施步骤如下：

(1)3'RACE PCR反应实施步骤：在反应体系为【模板(3'RACE cDNA)1μL，引物UPM Long(GTATCAACGCAGAGT–3')0.5μL，引物UPM Short(5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3')0.5μL，引物PGSP1(5'–CCTGCTCTACGACTTCTCCCGATTCA–3')0.5μL，ddH₂O 12.5μL，TaqMix10μL，总计25μL】中进行。3'RACE反应条件：使用Touchdown PCR 94℃变性5min；94℃30s，72℃3min反应5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃3min反应5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min反应27个循环；72℃延伸5min。

3'RACE反应产物琼脂糖凝胶切胶回收，连接到pMD19-T载体上后转化进大肠杆菌DH5α,送测序。

(2)5'RACE PCR反应实施步骤如下：

(2.1)5'RACE第一轮PCR：在反应体系【模板(5‘RACE cDNA)0.5μL，引物UPM Long0.5μL，引物UPM Short0.5μL，引物PGSP2(5'–CATACCGCAACGACTCCAGCAGAGCGCG–3')0.5μL，ddH₂O 13μL，TaqMix10μL，总计25μL】中进行。TouchdownPCR反应条件：94℃预变性3min；94℃40s，72℃30s，72℃1.5min反应5个循环；94℃40s，70℃30s，72℃3min反应5个循环94℃40s，68℃30s，72℃3min反应35个循环；72℃延伸5min。

(2.2)5'RACE第二轮PCR：将第一轮PCR反应稀释50倍(1st PCR×50)作为第二轮反应的模板。在反应体系【模板(1st PCR×50)0.5μL，引物UPM Long0.5μL，引物UPM Short0.5μL，引物PGSP3(5'–GAACTATGCTTGGAACTGGTCTTT–3')0.5μL，ddH₂O13μL，TaqMix10μL，总计25μL】中进行。Touchdown PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃40s，68℃30s，72℃1.5min反应5个循环；94℃40s，65℃30s，72℃3min反应5个循环；94℃40s，62℃30s，72℃3min反应35个循环；72℃延伸5min。将上述3'RACE和5'RACE反应产物切胶回收，连接到pMD19-T测序。测序所得结果进行生物信息学分析。

高保真酶KOD克隆八氢番茄红素合成酶基因DNA和cDNA序列：使用高保真酶KOD在反应体系【模板(DNA或cDNA 1μL，引物PSYT1(5’-CCATTTGCTCTCCTACTCTGGTCACT-3’)0.75μL，引物PSYT2 (5’-TGGTGCTCTGGCATCGACTGGTAAT-3’)0.75μL，10×Buffer 5μL，dNTP5μL，MgSO₄ 3μL，ddH₂O33.5μL，高保真酶KOD1μL，总计50μL】中进行。PCR反应条件(两步法)：94℃预变性2min；98℃10s，68℃1min进行35个循环；72℃延伸5min。PCR反应产物1％琼脂糖凝胶电泳。

PCR产物3'末端加A反应：将高保真酶KOD克隆的PCR产物切胶回收，将回收的DNA用Elution Buffer溶解，通过反应液加A反应：模板(胶回收DNA)10μL，10×PCR Buffer2μL，dNTP 3μL，TaqMix 0.25μL，ddH₂O4.75μL，总计20μL。PCR仪中72℃保温30min。将产物连接pMD19-T载体转化大肠杆菌DH5α，送生工生物有限公司测序。

八氢番茄红素酶基因功能验证：通过PCR反应体系【模板(cDNA)1μL，引物cPSY1(5’-TTGAATTCCATGGTAGACACTTTAGCCTTG-3')0.75μL，引物cPSY2(5’-CCCTCGAGTTCCTGGTTACCCAGCATTCAA-3')0.75μL，10×Buffer 5μL，dNTP5μL，MgSO43μL，ddH₂O 33.5μL，高保真酶KOD 1μL】，在PCR反应条件：94℃预变性2min；98℃10s，60℃30s，68℃1min进行35个循环；72℃延伸5min下克隆八氢番茄红素cDNA。将克隆产物进行3’端加A反应，与pMD19-T载体连接，转化至XL1-Blue感受态细胞，培养获得单克隆，抽提质粒经EcoR I与Xho I双酶切。同样，pET32a表达载体经克隆和质粒抽提，EcoR I与Xho I双酶切。双酶切反应体系：EcoR I(10U/μL)0.5μL，Xho I(10U/μL)0.5μL，重组质粒20μL，10×H Buffer5μL，ddH₂O 24μL，总计50μL。pACCAR25ΔcrtB质粒的XL1-Blue。双酶切产物经电泳切胶回收pET32a和八氢番茄红素合成酶基因片段。

将八氢番茄红素合成酶基因片段8μL和pET32a骨架1μL混合，45℃加热5min以使重新退火的粘端解链，将混合物放置在冰上冷却到0℃。在以上混合液中加入10×T4DNA ligase buffer 2.5μL，T4DNA ligase 1μL，ddH₂O 12.5μL总计25μL。在16℃过夜连接获得pET32a-crtB质粒。

将pET32a-crtB质粒转化进携带有pACCAR25ΔcrtB(含有crtE、crtI、crtX、crtY、crtZ，但是缺少crtB八氢番茄红素合成酶基因)质粒的XL1-Blue的感受态细胞中。经颜色互补反应验证八氢番茄红素基因的功能：在LB双抗平板上：(1)XLI-Blue细菌，由于不带有抗性基因，所以不能生长；(2)携带pET32a-crtB质粒的XLI-Blue细菌，含有Cm抗性基因，但没有Amp抗性基因，所以也不能生长；(3)只携带PACCAR25△crtB质粒的XLI-Blue细菌，含有Amp抗性基因，但没 有Cm抗性基因，所以也不能生长；(4)携带pET32a和pACCAR25△crtB质粒的XLI-Blue细菌，含有Cm和Amp抗性基因，所以能生长，但没有PSY基因，不能合成玉米黄素，菌落呈白色；(5)携带pET32a-crtB和pACCAR25△crtB双质粒的细菌，既能在LB双抗平板生长，又能合成玉米黄素，显示出黄色的菌落。实验表明所克隆的八氢番茄红素合成酶基因crtB编码的蛋白具有催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸GGPP合成八氢番茄红素的功能。实施平板实验结果见图1。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。