本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性分子标记Wnt7b的检测方法及其应用。
背景技术：
肠炎沙门氏菌属于革兰氏阴性杆菌，超过2500多种血清型，不仅能引起畜禽发病，造成养殖业严重经济损失，而且也是食源性疾病的主要病原菌之一，能通过家禽副产品给人类的健康带来较大威胁，是报道最频繁的致病微生物之一。有关报道指出，2004年期间，在美国每1百万人中有19000人因感染沙门氏菌而住院，多达300人因沙门氏菌感染出现死亡；在欧盟，2010年间约有99020起因沙门氏菌感染引起的食源性疾病暴发。
家禽及其相关加工产品是肠炎沙门氏菌的主要传染源，肠炎沙门氏菌能够透过蛋壳进入鸡蛋产品中，且能在生殖道中寄存繁殖。目前控制沙门氏菌感染的方法主要是使用疫苗和抗生素，但这不能从根本上解决问题，而且抗生素的大量使用会引起食品安全问题及细菌的耐药性，且造成菌株耐药性增强。随着分子遗传学的发展，提高畜禽对疾病和病原的遗传抗性，为控制沙门氏菌感染提供可能性，但是现有技术中缺乏相应的技术启示存在。
基因Wnt7b属于Wnt信号分子蛋白家族一类分泌性型蛋白，人们所熟悉的Wnt/Wingless/Notch和Hippo等通路及调控他们关键的调节因子，最初都是在果蝇中发现，之后被深入研究(Dierick et al.,1987；Ingham et al.,1991；Kidd et al.,1983；Wu et al.,2003)Wnt信号通路由细胞外的配体蛋白、细胞膜受体及细胞浆内的信号转到部分和转录调控部分组成。Wnt信号通路分为两大类：一类是Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b和Wnt8经典途径和Wnt4、Wnt5a和Wnt11非经典途径(Rajagopal et al.,2008)。rs313644723位点位于Wnt7b基因的上游区域，但还没有关于该位点的基因型分型及其与肠炎沙门氏菌感染抗性相关性的研究。
技术实现要素：
本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性分子标记Wnt7b的检测方法及其应用，该方法提供了鸡Wnt7b基因rs313644723位点分型的特异性引物及配合该引物使用的基因分型PCR条件，利用上述引物和方法，可以准确检测肠炎沙门氏菌感染抗性相关位点基因型，为鸡抗肠炎沙门氏菌感染抗性个体的筛选和抗病育种提供理论基础和科学依据。
发明人提供的具体技术方案如下：
本发明所述的鸡肠炎沙门氏菌感染抗性分子标记为Wnt7b基因rs313644723位点；
发明人首先根据鸡Wnt7b(NM_001037274)基因rs313644723位点两侧序列，设计提供了用于基因分型的引物如下表所示；
在上述引物的基础上，发明人利用上述特异性分型引物进行分型PCR扩增，其PCR扩增反应体系如下表。
基因分型PCR体系(20uL)
PCR反应程序：95℃2min，40个循环(94℃30s，56℃90s，65℃30s)，65℃10min。
根据上述方法扩增后对扩增产物进行测序，获得每个个体的基因型，之后利用SAS方差分析和平板计数法，获得鸡盲肠内容物含菌量与SNP基因型相关性结果，见下表：
SNP位点基因型和盲肠内容物肠炎沙门氏菌含菌量相关性分析
由上表可以看出，不同基因型个体的盲肠含菌量存在明显差异，TT基因型个体盲肠含菌量显著高于CC型个体(P<0.05)，可见Wnt7b基因rs313644723位点与鸡肠炎沙门氏菌抗性相关，CC基因型个体对肠炎沙门氏菌感染抗性高于TT基因型。该位点可以作为鸡肠炎沙门氏菌抗性育种的分子标记，在实际育种过程中，可以选择CC基因型个体，以提高鸡群对肠炎沙门氏菌感染的抗性，从而实现鸡肠炎沙门氏菌感染抗性分子标记Wnt7b在鸡抗肠炎沙门氏菌感染的育种中的应用。
上述过程中的待测鸡只为人工接种鸡只，方法如下：
利用平板计数法，对刚孵化的济宁百日鸡进行肠炎沙门氏菌阴性检测，选择190只肠炎沙门氏菌阴性个体进行接种试验。
利用口服法，对每只鸡接种109cfu(菌落形成单位)肠炎沙门氏菌，接种后第7天，进行屠宰，收集盲肠内容物，利用平板计数法，测定每只鸡盲肠内容物含菌量。
综上所述，本发明提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性分子标记Wnt7b的检测方法及其应用，该方法提供了鸡基因rs313644723位点分型的特异性引物及配合该引物使用的基因分型PCR条件，利用上述引物和方法，可以准确检测肠炎沙门氏菌感染抗性相关位点基因型，为鸡抗肠炎沙门氏菌感染个体的筛选和抗病育种提供理论基础和科学依据。
具体实施方式
下述实施例中除特殊说明之外，所采用的均为本领域现有技术；
实施例1
待测鸡的获得
待测鸡为人工接种鸡只，方法如下：
利用平板计数法，对刚孵化的济宁百日鸡进行肠炎沙门氏菌阴性检测，选择190只肠炎沙门氏菌阴性个体进行接种试验。
利用口服法，对每只鸡接种109cfu(菌落形成单位)肠炎沙门氏菌，接种后第7天，进行屠宰，收集盲肠内容物，利用平板计数法，测定每只鸡盲肠内容物肠炎沙门氏菌含量。
基因分型及与盲肠内容物含菌量相关性分析
引物序列：
发明人利用上述特异性分型引物进行PCR扩增，其PCR扩增反应体系如下表。
基因分型PCR体系(20uL)
PCR反应程序：95℃2min，40个循环(94℃30s，56℃90s，65℃30s)，65℃10min。
根据上述方法扩增后对扩增产物进行测序，获得每个个体的基因型，之后利用SAS方差分析，获得鸡盲肠内容物含菌量与SNP基因型相关性结果，见下表：
SNP位点基因型和盲肠内容物肠炎沙门氏菌含菌量相关性分析
由上表可以看出，不同基因型个体的盲肠含菌量存在明显差异，TT基因型个体盲肠含菌量显著高于CC型个体(P<0.05)，可见Wnt7b基因rs313644723位点与鸡肠炎沙门氏菌感染抗性相关，CC基因型个体对肠炎沙门氏菌感染的抗性高于TT基因型。该位点可以作为鸡肠炎沙门氏菌抗性育种的分子标记，在实际育种过程中，可以选择CC基因型个体，以提高鸡群对肠炎沙门氏菌感染的抗性，从而实现鸡肠炎沙门氏菌感染抗性分子标记Wnt7b在鸡抗肠炎沙门氏菌感染的育种中的应用。