高选择性四环素类抗生素分子印迹聚合物制备方法及应用与流程

本发明涉及食品安全检测领域，具体涉及一种四环素类抗生素分子印迹聚合物的制备方法及使用其进行四环素类抗生素检测的方法。

背景技术：

抗生素是具有杀菌或抑菌作用的一类化学物质的总称，可用于治疗人和动物由于细菌感染而造成的疾病。自20世纪40年代欧美尝试在家禽饲养中使用抗生素以来，饲用抗生素的应用已有近70年的历史，其发展可分为三个阶段。20世纪50～60年代为第一阶段，饲用抗生素为人畜共用的抗生素。60年代，人们逐步认识了细菌耐药性的产生及其转移机制和饲用抗生素对人类健康的可能危害，提出应将饲用抗生素与人用抗生素分开，并开始研制专用饲用抗生素。20世纪80年代进入第三阶段，重点是筛选研制无残留、无毒副作用、无抗药性的专用饲用抗生素。总体来讲，饲用抗生素的发展与人类使用抗生素的历史几乎同步。随着动物养殖规模不断增大，动物性食品的需求成倍增加，饲用抗生素的使用在20世纪70年代达到了顶峰。

中国养殖业是抗生素使用量最大的领域，超过国内抗生素消费总量的一半。2006年国内抗生素总产量为21万吨，国内消费量约18万吨，其中，用于畜牧及饲料行业的抗生素就高达9.7万吨，约占54％。

动物大量使用某一种抗生素；而这种动物又是大众的常用食品，那么大众就等于在间接地食用这些抗生素；如果大众长期低剂量的食用这种抗生素，就可能对这种抗生素产生耐药性。一旦人体对这种抗生素产生抗药性，在医院治疗中使用同种抗生素的效果就会大打折扣。"在医院里一些患者用某些小剂量的抗生素本可以起到效果，但现在必须用量很大，而且还要使用广谱长效的抗生素才能起效，就是因为在日常生活中这些人就已经对某些抗生素产生耐药性了。在日常动物性食品里面，如果长期大剂量使用某些抗生素，人体就产生了抗药性或者耐药性。"

饲用抗生素的滥用，也导致人畜共患病增多。全世界已知的人畜共患病超过200种，其中有100多种动物疾病能直接传染给人类。动物所带的任何耐药菌均可能直接或间接地传递给人类，增加人畜共患病的感染机会。此外，某些抗生素虽然没有直接伤害人体，但是改变了人体内的菌群组成，降低了肠胃功能，妨碍了营养物质的吸收，从而导致营养不良。

因此，如果能够快速准确地检测出食物中的抗生素残留，将会为人类健康和食品安全提供更好的保障。

目前，人们已经开始使用分子印迹来进行抗生素的检测。但是现有技术中，分子印迹检测的印迹因子均不是十分理想。

Hu等(Hu X,Pan J,Hu Y,et al Preparation and evaluation of solid-phase microextraction fiber based on molecularly imprinted polymers for trace analysis of tetracyclines in complicated samples.Journal of Chromatography A,2008,1188:97-107)以四环素为模板，采用分子印迹技术在毛细管内壁制备一层MIPs涂层以选择性的萃取复杂样品中的四环素类抗生素。然而MIPs涂层的萃取容量仅为NIPs(空白聚合物)涂层萃取容量的3.9倍(OTC)、3.9倍(TC)、2.4倍(CTC)和2.1倍(DOX)。

Cai等以TC为模板分子，采用本体聚合法制备了一种MIPs，其最大吸附容量仅为3.8mg g^-1(TC)，远远不能满足应用需要。

因此，目前亟需获得一种食品样品中快速、灵敏、高效的四环素类抗生素的检测试剂及相应的检测方法。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明希望提供一种能够准确检测出抗生素残留的分子印迹聚合物的制备方法及相应检测方法。

具体而言，本发明提供一种高选择性四环素类抗生素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述方法利用模板分子、甲基丙烯酸(MAA,6mmol)、交联剂(TRIM,3mL)、引发剂进行高选择性四环素类抗生素分子印迹聚合物的制备。

在一种优选实现方式中，所述方法包括下述步骤：

(1)、制备目标抗生素模板分子；

(2)、在容器中加入第一预定量致孔剂；

(3)、将所述模板分子、甲基丙烯酸(MAA,6mmol)、交联剂(TRIM,3mL)、引发剂分别溶入所述致孔剂中；

(4)、对所获得的混合溶液进行超声脱气；

(5)、对所述混合溶液进行通氮除氧；

(6)、封闭所述容器；

(7)、将所述容器置于预定温度的水浴环境中，进行搅拌，使其发生反应；

(8)、反应结束后，收集所获得的聚合物微粒，利用甲醇/乙酸的混合液进行索氏提取，除去模板分子；

(9)、利用甲醇对剩余聚合物进行索式提取，以除去乙酸；

(10)、将剩余聚合物置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到用于对抗生素残留进行检测的分子印迹聚合物(MIPs)。

在另一种优选实现方式中，所述模板分子包括第一模板分子和第二模板分子。

在另一种优选实现方式中，所述方法还包括将所述分子印迹聚合物溶解于预定溶剂中。

在另一种优选实现方式中，所述致孔剂的含量为60mL、甲基丙烯酸的含量为6mmol、交联剂的含量为3mL、引发剂的含量为30mg。

在另一种优选实现方式中，在所述步骤(8)中甲醇/乙酸的比例为9:1。

另一方面，本发明提供一种四环素类抗生素的高精度检测方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)、制备目标抗生素模板分子；

(2)、在容器中加入第一预定量致孔剂；

(3)、将所述模板分子、甲基丙烯酸(MAA,6mmol)、交联剂(TRIM,3mL)、引发剂分别溶入所述致孔剂中；

(4)、对所获得的混合溶液进行超声脱气；

(5)、对所述混合溶液进行通氮除氧；

(6)、封闭所述容器；

(7)、将所述容器置于预定温度的水浴环境中，进行搅拌，使其发生反应；

(8)、反应结束后，收集所获得的聚合物微粒，利用甲醇/乙酸的混合液进行索氏提取，除去模板分子；

(9)、利用甲醇对剩余聚合物进行索式提取，以除去乙酸；

(10)、将剩余聚合物置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到用于对抗生素残留进行检测的分子印迹聚合物；

(11)、将制备所得的分子印迹聚合物悬浮于预定液体中，用真空泵将其填入不锈钢色谱空柱中，制成MIPs或NIPs填充柱，向所述填充柱中加入被测样品；

(12)、并将填充柱联入高效液相色谱仪，观测吸附情况。

技术效果

本发明采用沉淀聚合法，制备了一种规则的球形MIPs，其对四环素一族均表现为较好的特异性吸附能力，非常适合作为固相萃取的吸附剂，实现复杂样品中痕量四环素类抗生素的净化和富集。本发明所制备的四环素类抗生素分子印迹聚合物对四环素类抗生素的最大吸附容量分别为27μmol g^-1(OTC),35μmol g^-1(TC),35μmol g^-1(CTC)和39μmol g^-1(DOX)，远高于目前现有技术中所能实现的吸附容量。

附图说明

图1为本发明的抗生素残留检测方法的示意性流程图；

图2为采用不同模板获得的分子印迹聚合物的电镜形貌图，其中，a为OTC，b为TC；c为CTC，d为DOX，e为OTC+CTC。

具体实施方式

以下结合附图及其实施例对本发明进行详细说明，但并不因此将本发明的保护范围限制在实施例描述的范围之中。

实施例1

本实施例中会用到下述试剂：四环素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、强力霉素(DOX)、甲基丙烯酸(Methacrylic acid,MAA)、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(Trimethylolpropane trimethylacrylate,TRIM)，上述各个试剂均购自Sigma公司(USA)。本实施例中还用到甲醇(色谱纯)，乙腈(分析纯)，偶氮二异丁腈(2,2-azobisisobutyronitrile,AIBN)，这些试剂均购自天津科密欧试剂公司。其中，MAA需要在氮气保护下避光减压蒸馏以去除其中的阻聚剂并避光保存。AIBN需要用甲醇热溶解，过滤，冷却结晶后烘干备用。

McIlvaine缓冲液是这样配制的：精确称取11.8g柠檬酸，13.72g磷酸氢二钠和33.62g乙二胺四乙酸二钠并用超纯水溶解，置于棕色容量瓶中定容至1.0L，常温保存。

四环素类抗生素标准溶液的配置：精确称取一定量的OTC、TC、CTC、DOX用甲醇溶解，置于棕色容量瓶中定容至10mL，4℃保存。

本实施例中所采用的仪器包括：Waters 2695型高效液相色谱仪，Waters2996型二极管阵列检测器，RH digital KT/C safety control(数显型)加热磁力搅拌器(德国)、岛津UV-2450紫外分光光度计(日本)，THZ-100型恒温培养摇床(上海一恒科技有限公司)，DZF-6021型干燥箱(上海一恒科技有限公司)及SH2-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)。

本实施例中，抗生素检测试剂——分子印迹聚合物的制备方法如下：

(1)、准备目标抗生素模板分子，本实施例中，分别采用四环素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、强力霉素(DOX)四种中的一种作为模板分子。

(2)、在100mL的圆底玻璃瓶中加入60mL致孔剂，致孔剂为甲醇与乙腈的混合溶液；

(3)、将模板分子(OTC,TC,CTC或DOX)、甲基丙烯酸(MAA,6mmol)、交联剂(三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯TRIM,3mL)、引发剂(偶氮二异丁腈AIBN,30mg)溶于致孔剂中；

(4)、对所获得的混合溶液进行超声脱气5min；

(5)、对所述混合溶液进行通氮除氧5min；

(6)、封闭所述容器；

(7)、将所述容器置于55℃水浴锅内，进行搅拌，100～120转/分搅拌24h，使其发生反应；

(8)、反应结束后，收集所获得的聚合物微粒，利用甲醇/乙酸(9/1,V/V)的混合液进行索氏提取24h，除去模板分子；

(9)、利用甲醇对剩余聚合物进行索式提取12h，以除去乙酸；

(10)、将剩余聚合物置于40℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到用于对抗生素残留进行检测的分子印迹聚合物(MIPs)。

在本实施例中，分别单独地利用四环素类抗生素进行了分子印迹聚合物的制备。

就土霉素分子印迹聚合物而言，TC，CTC和DOX在此MIPs上的印迹因子均高于9.3，这与土霉素的分子结构密切相关。

与其他的四环素类抗生素相比，OTC分子上不仅3-OH和4-N(CH₃)₂可以与MAA上的COOH产生氢键作用力，而且C-5，C-6位上的羟基(-OH)同样可以和MAA发生氢键作用力。因此，土霉素印迹聚合物对TC，CTC和DOX的选择性要优于其他印迹聚合物(参见表1)。

此外，根据相关文献报道：OTC十分不稳定，在pH为7的水溶液中半衰期仅为26h。因此，本发明将1mmol OTC用致孔剂溶解并置于恒温水浴中(55℃)孵育24h，以探讨模板分子在聚合过程中的降解情况。结果表明：在聚合过程中52％OTC逐步发生了降解，降解产物主要为4-Epi-OTC，α-Apo-OTC和β-Apo-OTC^[23,24]。由此可见，在MIPs的制备过程中，由于模板分子的结构发生了改变，使得印迹孔穴中功能位点的排列更趋于选择性识别TC，CTC和DOX，因而对自身(OTC)的印迹效果极差，印迹因子仅为2.0。

这一问题在后续实施例中得到了解决。

实施例2

在本实施例中，在分别制备针对四种四环素类抗生素的分子印迹聚合物基础上，制备了双模板分子印迹聚合物。目前，特异性识别四环素类抗生素的MIPs大多采用OTC和TC作为模板分子进行制备，尚未有文献报道采用CTC和OTC为模板分子制备MIPs。

本实施例的制备方法如下：

(1)、准备目标抗生素模板分子，本实施例中，采用土霉素(OTC)、金霉素(CTC)两种模板分子。

(2)、在100mL的圆底玻璃瓶中加入60mL致孔剂，致孔剂为甲醇与乙腈的混合溶液；

(3)、将1：1的OTC和CTC模板分子、甲基丙烯酸(MAA,6mmol)、交联剂(三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯TRIM,3mL)、引发剂(偶氮二异丁腈AIBN,30mg)溶于致孔剂中；

(4)、对所获得的混合溶液进行超声脱气5min；

(5)、对所述混合溶液进行通氮除氧5min；

(6)、封闭所述容器；

(7)、将所述容器置于55℃水浴锅内，进行搅拌，100～120转/分搅拌24h，使其发生反应；

(8)、反应结束后，收集所获得的聚合物微粒，利用甲醇/乙酸(9/1,V/V)的混合液进行索氏提取24h，除去模板分子；

(9)、利用甲醇对剩余聚合物进行索式提取12h，以除去乙酸；

(10)、将剩余聚合物置于40℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到用于对抗生素残留进行检测的分子印迹聚合物(MIPs)。

通过OTC和CTC摩尔比值的优化，考察不同组成的MIPs对于四环素一族的分子识别能力的差异。申请人发现：当OTC和CTC的摩尔比值为1/1时，制备的MIPs对四环素一族均表现出较好的分子识别性能和吸附容量，因而在实际应用中可以从复杂样品中选择性的萃取四环素类抗生素，非常适合作为固相萃取的吸附剂。

表1 MIPs和NIPs的制备和色谱法评估

从表一中可以看出，双模版聚合物的总体效果优于其他模板的聚合物的效果。首先解释一下各数值代表的含义：“B_t”代表亲和位点总数，是聚合物上能有目标物作用的位点的总和，这个数值越大读目标物的亲和力越大；“K_d”代表聚合物在吸附目标物时的解离常数，其值也表示聚合物与目标物亲和力大小，值越小的话，两者亲和力越大；“I”为印迹因子，代表了MIP对目标物的吸附与NIP对目标物吸附的能力的比值，其值越大说明MIP比NIP对目标物就有更好的选择性。综上，综合考虑各种聚合物对四种目标的吸附，欲达到对四种目标物的较好的选择性吸附效果，本发明的双模板分子印迹聚合物是性能最优的。

实施例3

在本实施例中，依然制备双模板MIPs，只是在本实施例中，采用不同溶剂对所获得的分子印迹聚合物进行溶解，并且对抗生素进行识别。

所采用的溶剂分别为水、甲醇、乙腈、甲醇/乙腈混合液(1/1,V/V))。

本发明分别对采用四种溶剂的情况下模板MIPs对四环素类抗生素的识别能力进行了测试。

结果表明：在乙腈溶液中四环素类抗生素在双模板MIPs上的保留效果最好，最大吸附容量分别为27μmol g^-1(OTC),35μmol g^-1(TC),35μmol g^-1(CTC)和39μmol g^-1(DOX)。而水作为一个强极性的溶剂，可以与MAA上的COOH产生氢键作用力，因而可以与模板分子竞争印迹孔穴，降低MIPs对四环素类抗生素的吸附容量。由此可见氢键作用力是双模板MIPs分子识别的主要作用力。

此外，本发明还对采用Sirion 200FEI高分辨场发射扫描电镜(FESEM,Sirion 200,FEI,Holland)对聚合物的形貌进行分析。

如图2所示，在上面实施例中的合成条件下，以TC(b)和DOX(d)为模板的分子印迹聚合物的形貌类似巨石状，密度较为致密，而以CTC(c)为模板的分子印迹聚合物的形貌类似多孔材料，可以看到很多的孔道，密度较为松散。以OTC(a)为模板的分子印迹聚合物的形貌特别不规则，其主要的原因可能是OTC分子的极性较强，在致孔剂中的溶解性偏低所致。令人感兴趣的是OTC+CTC双模板制备的MIPs(e)表现为一种球状结构，可以看到很多孔结构且密度要比CTC印迹聚合物更加致密。单从外观形貌分析，双模板MIPs就非常适合作为固相萃取的吸附剂。而且，上面已经证实了其在吸附容量和吸附效果上的优势。所以，OTC+CTC双模板制备的MIPs相对于其他模板具有显著的优势。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的保护范围之内。

虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。