基于光纤微腔回音壁的DNA杂交微流控探测器的制作方法

本发明涉及一种光纤回音壁DNA杂交微流控探测器，特别是涉及一种基于微纳光纤辅助的微腔回音壁DNA杂交微流控探测器，属于传感探测技术领域。

与传统DNA探测手段相比，其性能在探测灵敏度及微型化尺寸上解决了痕量DNA样本检测的难题。

背景技术：

自从人类基因组计划实施以来，越来越多的生物基因序列得到确定，但是一旦某一序列出现混乱，快速测序及准确辨识混乱序列的基因检测技术将会成为科研工作者的研究目标。因此，探索新型、高效、准确的DNA检测技术对大量遗传信息的分析显得尤为重要。

随着光纤技术的突破与发展，光纤结构设计灵活，模式调控手段丰富，高度集成化尺寸，为无标记DNA探测器件的发展提供了技术支持。其中光纤回音壁模式因为具有更小的模式体积和极高的品质因子，使其在高精度生物检测方面具有重大应用价值。光由光密介质向光疏介质传输，当入射角度足够大时，会发生全反射，在弯曲的高折射率界面内，光会被限制在闭合的腔体边界内，保持稳定的行波传输模式，此即为回音壁模式。对于回音壁微谐振腔内的模式，主要能量被束缚在介质腔内，还有一部分能量在腔界面全反射处，由于古斯-汉森相移，泄露于微腔外部表面环境中，这就是模式的倏逝场，这部分能量以指数衰减的形式分布在微腔外表面几百纳米到一微米的范围内。当微谐振腔外部环境发生变化或微腔外表面粘附纳米颗粒或生物分子时，就会引起回音壁共振模式的频率漂移，因回音壁模式体积很小，且具有很高的品质因子，其谱线线宽非常窄，谱线很微小的漂移也很容易被检测到，因此，在精细和微量生物探测方面具有重大应用潜力。

目前，大多采用拉锥光纤近场外部耦合方式将光耦合进环形微腔，实现高效率的回音壁模式激发和耦合。此时拉锥光纤的直径一般要求小于2微米，且锥区较长，以降低因直径减小对传输光能量的限制损耗。但直径小于2微米的光纤十分脆弱，空气粉尘污染和扰动对细锥光纤的影响很大，且超净实验环境苛刻。鉴于以上不足，研究高鲁棒性，高耦合效率，高度集成的光纤回音壁模式耦合方式是顺应当今医疗需求的发展目标。

技术实现要素：

本发明目的是克服现有技术的上述不足，提供一种基于微纳光纤辅助的微腔回音壁DNA杂交微流控探测器。它可以保证具有较强的近场倏逝波耦合，且结构紧凑，鲁棒性和稳定性高，也可以对待测DNA杂交进行实时无标记高灵敏探测。

本发明的技术方案是：

一种基于光纤微腔回音壁的DNA杂交微流控探测器，至少包括一个光纤近场耦合结构，一个空芯石英光纤，单模光纤。所述的光纤近场耦合结构是由微光纤辅助的“U”型微腔结构构成，包括一段百微米长度的拉锥微光纤，拉锥微光纤两端分别与普通单模光纤错位熔接，错位量为拉锥单模光纤的半径，从而形成“U”型空气微腔。所述拉锥微光纤无需很细，直径在30～62.5μm之间，可保证有较强的鲁棒性和倏逝场强度。“U”型空气微腔两端分别通过单模光纤与稳定的窄带激光光源和高分辨率光谱仪相连。由于在熔接点引入较大错位，由单模光纤入射的光在错位点分为两个部分，一部分进入拉锥微光纤的包层中传输，一部分通过空气腔进行传输，在拉锥微光纤的表面，部分光能量泄露出来形成倏逝场。空芯石英光纤垂直置于拉锥微光纤表面(“U”型微腔的长度必须大于空芯石英光纤的外径)，且其内壁表面上利用离子吸附作用修饰多聚赖氨酸分子(PLL)和单链DNA(ssDNA)探针分子，满足匹配条件的倏逝场即会耦合进入空芯光纤的石英壁内激发回音壁模式，通过靶ssDNA分子与固定在空心石英光纤内壁表面的ssDNA探针分子间的杂交引起所述空芯石英光纤内折射率变化而起作用。空芯石英光纤作为微流通道，其两端通过微流管分别与蠕动注射泵和废液杯相连，便于生物分子偶联剂、DNA探针及多组待测DNA样本等试剂的注入和更换，保证DNA检测的连续性和实时性，并可避免人工操作中的污染。

本发明的具体原理是：所述空芯石英光纤经HF酸腐蚀至石英壁厚小于5μm。利用石英光纤表面本身和ssDNA带有负电荷的特性，选用带有氨基的PLL作为连接光纤与ssDNA探针的偶联剂，实现ssDNA探针分子在空芯石英光纤内壁的固定。当空芯石英光纤内注入与ssDNA探针相互匹配的靶ssDNA样本后，靶ssDNA分子即会被固定于石英管内壁的ssDNA探针捕获，并发生杂交。由蠕动注射泵向石英管内注入偶联剂、ssDNA探针和靶ssDNA样本的过程中，大量分子聚集于石英管壁内表面。石英管壁内存在稳定的行波传输，即回音壁模式，且有部分能量以倏逝场的形式存在于空芯石英光纤壁内表面，这部分能量以指数衰减的形式分布在空芯石英光纤壁表面几百纳米到一微米的范围内。空芯石英光纤内壁进行PLL分子修饰和ssDNA探针固定以及DNA杂交反应时，石英光纤内壁表面的介质折射率改变，就会引起回音壁共振模式的频率漂移，因回音壁模式体积很小，且具有很高的品质因子，其谱线线宽非常窄，谱线很微小的漂移或分裂也很容易被检测到。因此，通过解调回音壁谐振光谱的波长漂移或模式劈裂响应可实现对DNA分子的杂交及识别探测。

本发明具有如下优点：

1)可精确控制近场耦合光纤微腔长度实现几十～几百微米不等微型尺寸，大大缩短拉锥微纤的长度，增强倏逝场强度，提高结构的鲁棒性。

2)回音壁模式的高品质因子和小模式体积，提高DNA检测的准确性、灵敏度和精细度，为单个DNA分子的识别提供技术基础。

3)以空芯光纤作为封闭式微流管，缩小微流通道尺寸，减少生物样本的消耗量。

4)微流系统的集成极大地提高了检测的连续性和实效性，自动化流程避免人工操作中的样本污染。

附图说明

图1是本发明所述DNA杂交微流控探测器的整体结构装置示意图。

图2为图1中虚线椭圆处局部放大图。

图3是本发明所述空芯石英光纤微流通道内DNA检测示意图。

图中：1光源(窄带激光光源)，2高分辨率光谱仪，3蠕动注射泵，4废液杯，5单模光纤，6微流管，7拉锥微光纤，8空芯石英光纤，9多聚赖氨酸(PLL)单分子层，10ssDNA探针，11ssDNA探针与靶ssDNA杂交的双螺旋DNA(dsDNA)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明。

实施例1

如图1所示，本发明所述的基于光纤微腔回音壁的DNA杂交微流控探测器，包括：5单模光纤，7拉锥微光纤和8空芯石英光纤，其中拉锥微光纤7的两端与单模光纤5错位熔接呈“U”型空气腔结构——即“U”型空气微腔，整体空气“U”型微腔结构的两端分别通过单模光纤5与稳定的窄带激光光源1和高分辨率光谱仪2相连。空芯石英光纤8与拉锥微光纤7垂直放置在“U”型空气微腔内，空芯石英光纤两端分别通过微流管6与蠕动注射泵3和废液杯4相连。

空芯光纤微流通道内DNA杂交检测示意图，如图2所示，空芯石英光纤内表面修饰PLL单分子层9，在离子吸附作用下ssDNA探针分子10与PLL结合，实现ssDNA探针分子在空芯石英光纤内表面的固定，这样对特定序列靶ssDNA分子敏感的探测器即制作完成，当有靶ssDNA分子存在的时，由于DNA碱基序列的特异识别机制，靶ssDNA分子被吸附到空芯石英光纤内壁表面，并与ssDNA探针分子杂交形成dsDNA 11。

在目标靶ssDNA分子存在时即会在空芯石英光纤内表面形成富集作用，并与固定在石英光纤内表面的探针ssDNA分子杂交。所述DNA杂交探头制作步骤中的试剂注入及更换都是通过微流系统连续注入。实时扫描回音壁透射光谱，即可对空芯石英光纤内表面修饰过程和DNA分子杂交过程进行动态解调。

本发明所述的基于光纤微腔回音壁的DNA杂交微流控探测器的制作过程如下：

1)光纤近场耦合结构的制备

(a)氢氧火焰扫描拉锥系统对单模光纤进行拉锥，拉制直径缓变的绝热锥。

(b)固定光纤切割刀及加持台，选取拉锥光纤直径范围在30～62.5μm的均匀部分切断。

(c)将微光纤断面与普通未拉锥单模光纤熔接，并采用错位手法，使微光纤的包层边缘对准单模光纤的中心线。

(d)微调光纤加持台，使熔接点平移一定位移(大于空芯光纤直径)，在固定的光纤切割刀位置截断拉锥微光纤。

(e)将带有一段微光纤的单模光纤与另一单模光纤熔接，保持相同方向且相同大小的错位量。利用以上所述步骤，两端同方向同量级的错位熔接形成“U”型空气腔，光纤微腔即制作完成。

2)对DNA敏感的回音壁模式谐振腔的制备

(a)选用内径90μm的空芯石英光纤，将其浸泡在氢氟酸：水：氟化铵为2:2:1的混合溶液中，腐蚀至石英管壁厚小于5μm。

(b)由微流泵注入0.01mg/mL的PLL/PBS(磷酸缓冲液)，充分反应，并用PBS冲洗。在石英管内壁表面修饰上PLL单分子层。

(c)注入ssDNA探针样本溶液，充分反应，并用TE缓冲液冲洗。完成ssDNA探针在石英管内壁表面上的固定。

3)DNA杂交的探测

选用C波段窄带激光器作为光源，分辨率为3pm的安捷伦光谱仪作为高分辨率光谱仪，空芯石英光纤外径90μm，内径80μm。针对不同浓度的与ssDNA探针匹配的靶ssDNA样本和不匹配ssDNA样本分别对本发明的探测灵敏度，探测极限，特异性进行测试。将在回音壁透射谐振光谱中的波长位置1552.477nm处，激起的第121阶高阶模作为解调对象，其对靶ssDNA样本的探测灵敏度高达1255.08nm/RIU，比传统检测技术高出一个数量级；样本浓度的探测极限为0.1nM；对应样本分析折射率分辨率可达2.39ⅹ10-⁶RIU；并且对不匹配ssDNA样本不具有吸附作用，显示出良好的DNA特异识别功能。