一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒及其使用方法与流程

本发明涉及基因工程技术领域，进一步涉及基于基因工程技术的生物检测方法，具体涉及一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒及其使用方法。

背景技术：

黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)俗称郎丝、黄腊丁、江颡，属鲶形目(Siluriformes)，鲿科(Bagridae)，黄颡鱼属(Pelteobagrus)，是我国江河湖泊常见的一种底栖小型经济鱼类，因其肉质细嫩，味道鲜美，深受消费者青睐。然而，作为易患病鱼类品种，黄颡鱼的养殖过程中时常有病害发生，报道的常见疾病主要有细菌性疾病、霉菌病、寄生虫、营养性疾病等。其中又以细菌性疾病危害最为严重，易导致黄颡鱼大规模死亡，给养殖户造成重大经济损失。导致黄颡鱼发病病原菌包括嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、舒伯特气单胞菌、维氏气单胞菌等。其中由维氏气单胞菌所引起疾病，是近年来在鲿科鱼类中时常出现的暴发性细菌病，症状表现为患病黄颡鱼体色加深、体表黏液增多，体表多处溃烂，肛门红肿出血、外突，头部下颌、鳃盖、鳍条基部充血发红，腹部膨胀。解剖腹腔中有大量粉红色腹水，肝脏肿大发白，肠壁糜烂，胆囊肿大。患病初期只有少量鱼死亡，后期出现大规模死亡，死亡率达到90％以上，通过分离鉴定确定该病的致病菌为维氏气单胞菌。

在此类疾病的防治工作中，及早诊断是控制疫情的关键环节，因此除了对症状的观察之外，直接针对病原微生物的分离检测显得尤为重要。维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)是革兰氏阴性杆菌，菌体略弯曲，属兼性厌氧菌，菌体大小为0.3～0.7μm×1.2～2.5μm。25～30℃时生长良好，在2～10℃的低温条件下以及42℃的较高温度条件下也可生长繁殖。该菌在普通营养琼脂上生长旺盛，培养24h后菌落直径多在1.3mm，呈圆形、边缘整齐、表面光滑、灰白色，不透明、中央稍隆起，在血平板上生长良好，能形成明显的β-溶血。现有技术中针对维氏气单胞菌的检测方法较为粗放，普遍采用分离培养的方式，再通过对菌落特征或菌体特征的观察加以鉴定，其操作繁琐，耗时较长且准确性不高。现有技术中有研究者尝试通过PCR方式以特异性基于作为检测对象实现对维氏气单胞菌鉴定检测，然而目前阶段相关方法普遍以维氏气单胞菌16S rRNA和核酸酶基因作为检测的靶基因，实践发现其特异性不够理想，再加之引物设计和PCR条件不够合理等因素，导致检测的准确性、操作速度仍有待提升。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒及其使用方法，以解决现有技术中基于PCR技术的维氏气单胞菌检测方法准确性较低的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术中基于PCR技术的维氏气单胞菌检测方法由于所选择的检测靶基因不合理所导致的准确性较低的技术问题。

本发明要解决的再一技术问题是现有技术中针对维氏气单胞菌的部分检测方法操作繁琐、耗时较长。

本发明要解决的又一技术问题是本发明以gyrB基因和Aha基因为靶基因的维氏气单胞菌PCR检测方法，其引物性能有待提升。

本发明要解决的又一技术问题是本发明以gyrB基因和Aha基因为靶基因的维氏气单胞菌PCR检测方法，其PCR扩增效果不佳。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒，该试剂盒包括针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物和针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物。

作为优选，所述针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物是序列如SEQ IDNO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物。

作为优选，所述针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物是序列如SEQ IDNO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物。

作为优选，所述试剂盒还包括10×PCR buffer，dNTP，MgCl₂，rTaq DNA聚合酶，阳性质控品，阴性质控品。

作为优选，所述试剂盒还包括作为阳性质控品的维氏气单胞菌菌液和作为阴性质控品的ddH₂O。

同时，本发明还提供了一种应用上述试剂盒检测维氏气单胞菌的方法，包括以下步骤：

1)以待测样品溶液为PCR模板，以序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段为维氏气单胞菌gyrB基因上游引物，以序列如SEQ ID NO.2所示的DNA片段为维氏气单胞菌gyrB基因下游引物，以序列如SEQ ID NO.3所示的DNA片段为维氏气单胞菌Aha基因上游引物，以序列如SEQ ID NO.4所示的DNA片段为维氏气单胞菌Aha基因下游引物执行双重PCR扩增，得到扩增产物；

2)取步骤1)所得的扩增产物执行琼脂糖凝胶电泳，确认电泳结果中745bp处或419bp处是否具有条带。

作为优选，所述待测样品溶液是从黄颡鱼组织器官中分离出的微生物菌液。

作为优选，所述双重PCR扩增的反应体系如下：待测样品溶液1μL，10×PCR buffer 2.5μL，5U/μL的rTaq DNA聚合酶溶液0.25μL，250mmol/L的MgCl₂溶液1.5μL，20μmol/L的gyrB基因上游引物0.5μL，20μmol/L的gyrB基因下游引物0.5μL，20μmol/L的Aha基因上游引物0.6μL，20μmol/L的Aha基因下游引物0.6μL，2.5mmol/L的dNTP溶液0.5μL，ddH₂O补齐至25μL。

作为优选，所述双重PCR扩增的反应条件如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，55～65℃退火30s，72℃延伸30s，反应30～35次循环；72℃再延伸10min。

作为优选，所述退火的温度是61℃，反应循环次数为30次。

在以上技术方案中，所述阳性质控品和阴性质控品又分别称为阳性对照和阴性对照，二者分别为明确具有目的菌(维氏气单胞菌)的菌液和明确不具有目的菌的ddH₂O；二者作为PCR检测的参照物。在以上技术方案中，出现于745bp和419bp位置的条带分别用于表征gyrB基因和Aha的存在，在实际操作中，当一次检测同时出现上述两条条带的情况下可以认定为维氏气单胞菌阳性，仅有一条条带或不存在条带的情形则应当认定为维氏气单胞菌阴性。

本发明提供了一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒及其使用方法，该技术方案以促旋酶的B亚单位基因(gyrB)和黏附素基因(Aha)为靶基因设计了两对针对黄颡鱼源致病性维氏气单胞菌的高度特异性引物。

gyrB基因是单拷贝的看家基因，平均碱基替换率为每100万年变化0.7％～0.8％，比16S rDNA的每5000万年变化1％的速度要快，而且不发生水平转移，并普遍存在于各种细菌中。本发明通过实验手段发现gyrB基因比16SrRNA在区分和鉴定维氏气单胞菌及其近缘种上具有更显著的优势。Aha基因最早发现于1961年，被认为与大肠杆菌菌毛的合成有关，由于菌毛的附着力影响着许多致病菌的定殖能力，因此Aha基因被认为与部分致病菌的毒力有关。本发明人从患病黄颡鱼中分离的维氏气单胞菌中克隆了Aha基因，并发现具有致病性的维氏气单胞菌中Aha基因呈阳性。基于这种有益的发现，本发明选用其与gyrB基因共同作为PCR扩增的靶基因。

在此基础上，本发明设计了两组高特异性的检测引物，并围绕其建立了双重PCR的反应体系和反应条件，在此基础上形成了针对维氏气单胞菌检测试剂盒。该试剂盒的敏感性强、特异性高，可以快速、准确地检测黄颡鱼源致病性维氏气单胞菌，有效避免错检漏检。同时避免了反复培养、冗长的一系列生化反应，节约时间、劳动能力和成本。

附图说明

图1是本发明实施例1中以不同标准物为模板执行双重PCR扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳的结果图。图中M：DL 2000DNA marker；1：Aha基因；2：阴性对照；3：gyrB基因；4：阴性对照；5：gyrB基因-Aha基因混合物；6：阴性对照。

图2是本发明实施例1中以不同菌株溶液为模板执行双重PCR扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳的结果图。图中M：DL 2000DNA marker；1：维氏气单胞菌标准株ATCC35624；2：自然界中分离到的维氏气单胞菌；3：迟缓爱德华菌；4：副溶血弧菌；5：嗜水气单胞菌；6：肠道沙门氏菌；7：无乳链球菌；8：麦氏弧菌；9：金黄色葡萄球菌；10：大肠埃希氏菌；11：肺炎克雷伯菌；12：舒伯特菌；13：阴性对照。

图3是本发明实施例1中以维氏气单胞菌不同浓度的总DNA溶液为模板执行双重PCR扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳的结果图。图中M：DL 2000DNA marker；1：6.6ng/μL；2：6.6×10^-1ng/μL；3：6.6×10^-2ng/μL；4：6.6×10^-3ng/μL；5：6.6×10^-4ng/μL；6：6.6×10^-5ng/μL；7：6.6×10^-6ng/μL；8：阴性对照。

图4是本发明实施例1中以维氏气单胞菌不同浓度菌液为模板执行双重PCR扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳的结果图。图中：M：DL 2000DNA marker；1：3.2×10⁶cfu/mL；2：3.2×10⁵cfu/mL；3：3.2×10⁴cfu/mL；4：3.2×10³cfu/mL；5：3.2×10²cfu/mL；6：3×10¹cfu/mL；7：3×10⁰cfu/mL；8：阴性对照。

图5是本发明实施例1中以自然病例分离物(病料)为模板执行双重PCR扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳的结果图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1

1、引物的设计

根据GenBank中维氏气单胞菌的gyrB基因序列(KX058388)和Aha基因序列(登陆号：KU877437)设计和筛选出两对特异性片段引物。各引物序列和预期扩增片段长度如表1所示：

表1 gyrB基因、Aha基因特异性引物序列及预期扩增结果

2、双重PCR反应体系及反应条件

反应体系：待测样品溶液1μL，10×PCR buffer 2.5μL，5U/μL的rTaq DNA聚合酶溶液0.25μL，250mmol/L的MgCl₂溶液1.5μL，20μmol/L的gyrB基因上游引物0.5μL，20μmol/L的gyrB基因下游引物0.5μL，20μmol/L的Aha基因上游引物0.6μL，20μmol/L的Aha基因下游引物0.6μL，2.5mmol/L的dNTP溶液0.5μL，ddH₂O补齐至25μL。

反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，反应30次循环；72℃再延伸10min。

3、双重PCR扩增效果考察实验

分别以gyrB基因、Aha基因以及二者混合物作为模板执行上述双重PCR扩增，阴性对照以ddH₂O为模板，实验结果如图1所示。可以发现本实施例所选用的双重PCR反应条件可实现gyrB基因、Aha基因及其混合物的准确检出，条带与预期位置相符，对于gyrB基因与Aha基因混合物一次扩增可同时呈现两条条带。

4、双重PCR扩增的特异性验证实验

分别以维氏气单胞菌标准株ATCC35624、自然界中分离到维氏气单胞菌、迟缓爱德华菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、肠道沙门氏菌、无乳链球菌、麦氏弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、舒伯特菌溶液为模板执行上述双重PCR扩增，实验结果如图2所示。可以发现仅有维氏气单胞菌标准株ATCC35624和自然界中分离到维氏气单胞菌在745bp和419bp同时出现条带，且二者条带位置相一致；而其余菌株扩增均未出现条带。由此可见本实施例的检测方法对维氏气单胞菌特异性良好。

5、双重PCR扩增的灵敏性验证实验

5.1以维氏气单胞菌不同浓度的总DNA溶液为模板时的灵敏性实验

提取维氏气单胞菌标准株ATCC35624总DNA，配制6.6ng/μL的总DNA溶液，而后进行梯度稀释，分别以各浓度溶液为模板执行上述双重PCR扩增，实验结果如图3所示。可以发现当DNA浓度低至6.6×10^-3ng/μL时仍可得到清晰条带，可以认为该方法检测精度达10^-3ng/μL DNA数量级。

5.2以维氏气单胞菌不同浓度菌液为模板时的灵敏性实验

以维氏气单胞菌标准株ATCC35624配制3.2×10⁶cfu/mL浓度的菌液，而后进行梯度稀释，分别以各浓度的菌液为模板执行上述双重PCR扩增，实验结果如图4所示。可以发现当菌液浓度低至3.2×10²cfu/mL时仍可见条带，而3.2×10³cfu/mL的菌液浓度可保证条带清晰，因此可以认为该方法检测精度达3.2×10²cfu/mL的菌体浓度数量级。

6、双重PCR扩增方法对病料检测效果验证实验

收集病鱼，分离到菌株样品21份，以维氏气单胞菌标准株ATCC35624作为阳性质控品，无菌ddH₂O作为阴性质控品。结果2和11两份样品扩增出特异性目的条带。如图3所示，其中1-21依次为21个待检测菌株，22为阳性质控品，23为阴性质控品的扩增结果。将21份分离菌株通过传统的微生物生理生化鉴定技术结合16S rDNA分子生物学方法鉴定后，验证出双重PCR检测方法的准确性为100％。

实施例2

一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒，该试剂盒包括针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物和针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

所述针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物是序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物。

所述针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物是序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物。

所述试剂盒还包括10×PCR buffer，dNTP，MgCl₂，rTaq DNA聚合酶，阳性质控品，阴性质控品。

所述试剂盒还包括作为阳性质控品的维氏气单胞菌菌液和作为阴性质控品的ddH₂O。

一种应用上述试剂盒检测维氏气单胞菌的方法，包括以下步骤：

1)以待测样品溶液为PCR模板，以序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段为维氏气单胞菌gyrB基因上游引物，以序列如SEQ ID NO.2所示的DNA片段为维氏气单胞菌gyrB基因下游引物，以序列如SEQ ID NO.3所示的DNA片段为维氏气单胞菌Aha基因上游引物，以序列如SEQ ID NO.4所示的DNA片段为维氏气单胞菌Aha基因下游引物执行双重PCR扩增，得到扩增产物；

2)取步骤1)所得的扩增产物执行琼脂糖凝胶电泳，确认电泳结果中745bp处或419bp处是否具有条带。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

所述待测样品溶液是从黄颡鱼组织器官中分离出的微生物菌液。

所述双重PCR扩增的反应体系如下：待测样品溶液1μL，10×PCR buffer 2.5μL，5U/μL的rTaq DNA聚合酶溶液0.25μL，250mmol/L的MgCl₂溶液1.5μL，20μmol/L的gyrB基因上游引物0.5μL，20μmol/L的gyrB基因下游引物0.5μL，20μmol/L的Aha基因上游引物0.6μL，20μmol/L的Aha基因下游引物0.6μL，2.5mmol/L的dNTP溶液0.5μL，ddH₂O补齐至25μL。

所述双重PCR扩增的反应条件如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，反应35次循环；72℃再延伸10min。

实施例3

一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒，该试剂盒包括针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物和针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

所述针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物是序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物。

所述针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物是序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物。

一种应用上述试剂盒检测维氏气单胞菌的方法，包括以下步骤：

1)以待测样品溶液为PCR模板，以序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段为维氏气单胞菌gyrB基因上游引物，以序列如SEQ ID NO.2所示的DNA片段为维氏气单胞菌gyrB基因下游引物，以序列如SEQ ID NO.3所示的DNA片段为维氏气单胞菌Aha基因上游引物，以序列如SEQ ID NO.4所示的DNA片段为维氏气单胞菌Aha基因下游引物执行双重PCR扩增，得到扩增产物；

2)取步骤1)所得的扩增产物执行琼脂糖凝胶电泳，确认电泳结果中745bp处或419bp处是否具有条带。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

所述双重PCR扩增的反应体系如下：待测样品溶液1μL，10×PCR buffer 2.5μL，5U/μL的rTaq DNA聚合酶溶液0.25μL，250mmol/L的MgCl₂溶液1.5μL，20μmol/L的gyrB基因上游引物0.5μL，20μmol/L的gyrB基因下游引物0.5μL，20μmol/L的Aha基因上游引物0.6μL，20μmol/L的Aha基因下游引物0.6μL，2.5mmol/L的dNTP溶液0.5μL，ddH₂O补齐至25μL。

所述双重PCR扩增的反应条件如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，反应35次循环；72℃再延伸10min。

实施例4

一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒，该试剂盒包括针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物和针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

所述针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物是序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物。

所述针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物是序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物。

一种应用上述试剂盒检测维氏气单胞菌的方法，包括以下步骤：

1)以待测样品溶液为PCR模板，以序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段为维氏气单胞菌gyrB基因上游引物，以序列如SEQ ID NO.2所示的DNA片段为维氏气单胞菌gyrB基因下游引物，以序列如SEQ ID NO.3所示的DNA片段为维氏气单胞菌Aha基因上游引物，以序列如SEQ ID NO.4所示的DNA片段为维氏气单胞菌Aha基因下游引物执行双重PCR扩增，得到扩增产物；

2)取步骤1)所得的扩增产物执行琼脂糖凝胶电泳，确认电泳结果中745bp处或419bp处是否具有条带。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

所述双重PCR扩增的反应体系如下：待测样品溶液1μL，10×PCR buffer 2.5μL，5U/μL的rTaq DNA聚合酶溶液0.25μL，250mmol/L的MgCl₂溶液1.5μL，20μmol/L的gyrB基因上游引物0.5μL，20μmol/L的gyrB基因下游引物0.5μL，20μmol/L的Aha基因上游引物0.6μL，20μmol/L的Aha基因下游引物0.6μL，2.5mmol/L的dNTP溶液0.5μL，ddH₂O补齐至25μL。

实施例5

一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒，该试剂盒包括针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物和针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

所述针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物是序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物。

所述针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物是序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物。

一种应用上述试剂盒检测维氏气单胞菌的方法，包括以下步骤：

1)以待测样品溶液为PCR模板，以序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段为维氏气单胞菌gyrB基因上游引物，以序列如SEQ ID NO.2所示的DNA片段为维氏气单胞菌gyrB基因下游引物，以序列如SEQ ID NO.3所示的DNA片段为维氏气单胞菌Aha基因上游引物，以序列如SEQ ID NO.4所示的DNA片段为维氏气单胞菌Aha基因下游引物执行双重PCR扩增，得到扩增产物；

2)取步骤1)所得的扩增产物执行琼脂糖凝胶电泳，确认电泳结果中745bp处或419bp处是否具有条带。

实施例6

一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒，该试剂盒包括针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物和针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。