一种重组HEK‑293T细胞及其分泌的抗寨卡病毒融合蛋白的制作方法

本发明涉及引入外来遗传物质而修饰的细胞，具体涉及重组的HEK-293T细胞。

背景技术：

寨卡病毒(Zika virus)是黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)病毒，主要通过蚊虫叮咬传播、性接触传播，此外病毒可以通过胎盘。1947年病毒学家在乌干达发现ZIKA病毒，患者主要表现为发热、斑丘疹及关节酸痛，之后仅表现为零星发病和小规模流行。直到2007年在南太平洋的Yap岛爆发流行，随后在非洲、东南亚及南美洲相继出现在卡病毒感染病例。中国国家卫生计生委2016年2月9日通报，确诊一例输入性Zika病毒感染病例，截至目前共有10例输入性Zika病毒感染病例。临床研究证实Zika病毒能够通过胎盘，导致胎儿出现小头症。Guillaume Carteaux报道了1例成年人中Zika病毒感染引起的脑膜脑炎。Zika病毒感染成为严重的世界性公共卫生问题，同时给爆发疫情的国家和地区造成严重经济损失。世界银行最新公布的数据显示，在Zika病毒感染发生国，或疫情预计会大面积爆发的国家或地区，当地的国际游客数量料将骤减，其旅游业将因此损失639亿美元。我国地缘辽阔，夏季蚊虫滋生，为该疾病的传播创造了有利条件。

Zika病毒核酸为单股正链RNA，长10.8kb，编码一个前体蛋白，经病毒和宿主蛋白酶切割成3个结构蛋白(C、prM/M和E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。Zika病毒与登革热病毒同属于黄病毒科病毒，二者的核酸和蛋白同源性较高，目前国内外对登革热病毒研究报道较多，Beth-Ann G.Coller等采用昆虫细胞表达登革热E蛋白，接种小鼠和非人灵长类动物均表现出较好的免疫原性，攻毒试验表明该蛋白具有较好保护力，具有成为登革热病毒亚单位疫苗的潜力。此外，Zika病毒非结构蛋白，例如NS1、NS3和NS5等在病毒黏附、侵入和复制等过程中发挥重要作用。

Zika病毒感染已经成为影响人们健康的重要公共卫生因素，该疾病没有特效治疗方法，且尚没有商品化的疫苗，E蛋白结构域Ⅲ被认为是研发Zika疫苗的最佳候选蛋白，Kim MY和Poddar A等人研究均表明登革热病毒E蛋白结构域Ⅲ能刺激动物机体产生较高滴度保护性抗体，具有制备登革热病毒重组亚单位疫苗的潜力(Kim MY,Kim BY,Oh SM,Reljic R,Jang YS,Yang MS.Oral immunisation of mice with transgenic rice calli expressing cholera toxin B subunit fused to consensus dengue cEDIII antigen induces antibodies to all four dengue serotypes.Plant Mol Biol.2016Oct；92(3):347-56.Poddar A,Ramasamy V,Shukla R,Rajpoot RK,Arora U,Jain SK,Swaminathan S,Khanna N.Virus-like particles derived from Pichia pastoris-expressed dengue virus type 1glycoprotein elicit homotypic virus-neutralizing envelope domain III-directed antibodies.BMC Biotechnol.2016Jun 14；16(1):50.)。文献报道表明，带有IgG1Fc标签的融合蛋白可增强融合蛋白的免疫原性，其原理可能是延长了融合蛋白的半衰期或者增加了表达FcR抗原递呈细胞的摄入。另外，人IgG1Fc片段是人体自身成分，作为疫苗成分时发生免疫排异的风险较低。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组HEK-293T细胞，该重组HEK-293T细胞可稳定分泌表达抗寨卡病毒的融合蛋白。

本发明解决上述问题的技术方案如下：

一种重组HEK-293T细胞，其特征在于，该重组HEK-293T细胞是以HEK-293T细胞为宿主转染外源融合基因获得，其中所述的外源融合基因的核酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

上述重组HEK-293T细胞由如下方法制得：

(1)分别从GenBank中获取ZIKA病毒E蛋白结构域III(录入号为KU955594.1)和人IgG1Fc(录入号为JN222933.1)的核苷酸序列，并将二者采用柔性肽(GGGS)₃连接，然后进行密码子优化，得到如SEQ.ID.NO.1所示的融合基因；将所得到的融合基因的起始端和终止端密码子分别进行酶切，然后克隆至载体pMD19-T中，得到重组载体命pMD19-ZDIII-hFc；

(2)先取FUGW质粒用PacⅠ酶切后补平再用BamHⅠ酶切回收载体大片段，再取pCDNA3.0质粒先用BglⅡ酶切后补平再用BamHⅠ酶切后回收CMV启动子，然后用Roche ligation kit将所回收的载体大片段和CMV启动子连接后得到慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP；

(3)将慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP双酶切回收大片段，再将pMD19-ZDIII-hFc双酶切回收核酸序列如SEQ.ID.NO.1所示的融合基因ZDⅢ-hFc，然后将所回收的大片段与融合基因ZDⅢ-hFc在T4DNA连接酶作用下连接，转化stab3感受态细胞后涂布含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取得到慢病毒重组载体pLV-CMV-EGFP-ZDⅢ-hFc；

(4)将所述慢病毒重组载体pLV-CMV-EGFP-ZDⅢ-hFc与慢病毒包装辅助质粒共转染HEK-293T细胞，即得重组HEK-293T细胞。

所述的重组HEK-293T细胞可稳定分泌表达寨卡病毒与人源IgG1Fc融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的融合蛋白具有抗寨卡病毒生物活性。

本发明具有以下有益效果：

1、现有技术大多采用原核表达或酵母表达蛋白，上述方法制备的蛋白与天然蛋白在高级结构方法存在较大差异，本发明所选用的表达系统为HEK-293T细胞，得到的重组HEK-293T细胞具有与亲本细胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的规模生产；表达蛋白在表达细胞内能得到接近病毒蛋白的天然构象与修饰加工，抗原性好；重组细胞可以用转瓶高密度发酵培养，易于大量生产。

2、本发明在对Zika病毒基因哺乳动物细胞密码子偏嗜性基础上，首次利用慢病毒表达系统表达E蛋白结构域Ⅲ与人源IgG1Fc融合蛋白，该融合蛋白中的Zika病毒E蛋白结构域Ⅲ与人源IgG1Fc蛋白之间通过柔性肽(GGGS)₃连接，有利于后期纯化。

3、本发明的重组表达细胞系可以利用无血清培养基或低血清培养基进行培养表达，可以降低疫苗生产成本；

4、本发明抗原表达量高，利用普通细胞培养瓶皿培养，产量可达110mg/L。

附图说明

图1为慢病毒重组载体pLV-CMV-EGFP-ZDIII-hFc构建示意图。

图2为慢病毒重组载体pLV-CMV-EGFP-ZDIII-hFc酶切鉴定的电泳图，图中M为marker，1为挑选克隆。

图3为Western blot鉴定不同阳性克隆细胞中Zika病毒E蛋白结构域Ⅲ与人源IgG1Fc融合蛋白表达情况的电泳图；图中，条带1、2、3、4为随机挑选的四个重组阳性克隆细胞。

图4为重组细胞系HEK-293T-ZDⅢ-hFc不同代次细胞目的蛋白表达Western Blot电泳图；图中，条带1为阴性对照，条带2-9分别为第1、5、10、15、20，25，30，35代细胞培养上清Western Blot电泳结果。

图5为不同代次重组HEK-293T细胞表达的融合基因的RT-PCR电泳图；图中，M为Marker DL2000，条带1为阴性对照，条带2-9分别为第1、5、10、15、20，25，30，35代HEK-293T细胞表达的融合基因的RT-PCR结果。

图6为本发明所述融合蛋白纯化的吸光度图谱。

图7为本发明所述融合蛋白纯化各步留样的电泳图；图中，条带1为上样前样品；条带2为流穿峰样品；条带3为洗脱峰样品。

具体实施方式

实施例所涉及的材料及其来源如下所示：

HEK-293T细胞由广州伯尼兹生物科技有限公司保存；

stab3感受态细胞购自广州复能基因有限公司；

DL 2000Marker、DL 3000Marker、DL 5000Marker、DL10000Marker、Premix Ex Taq和去磷酸化试剂盒购自Takara公司；限制性内切酶Sal I﹑Xho I﹑BamH I﹑Nhe I、MluⅠ、T4DNA连接酶均为NEB公司产品；预染蛋白Marker购自SunShineBio公司；牛血清白蛋白和琼脂糖购自Amresco公司；二氨基联苯胺购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒为Axygen公司产品；质粒小量提取试剂盒购自OMEGA公司；二甲基亚砜、聚凝胺购自Sigma公司；胰蛋白胨及酵母提取物为Oxiod公司产品；0.25％胰蛋白酶、DMEM培养基及南美胎牛血清为Hyclon公司产品，Zika多克隆抗体购自美国Kerafast公司。

实施例1(重组细胞系的构建及检测)

1、编码Zika病毒结构域Ⅲ与人源IgG1Fc基因序列设计及制备

1.1编码Zika病毒结构域Ⅲ与人源IgG1Fc的基因序列设计

在Zika病毒Bahia03株(GenBank:ANA85188.1)基因的基础上进行序列优化和表达设计，在起始密码子前加有Kozak序列与Nhe I酶切位点与保护性碱基，在E蛋白结构域Ⅲ基因与人源IgG1Fc编码末端加有终止子与MluI酶切位点；得到的E蛋白结构域Ⅲ与人源IgG1Fc的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.2为SEQ ID NO.1翻译后的氨基酸序列。

1.2编码Zika病毒E蛋白结构域Ⅲ与人源IgG1Fc基因序列合成

Zika病毒E蛋白结构域Ⅲ与人源IgG1Fc基因序列由中美太和生物技术有限公司合成，具体方法如下，从GenBank中获取ZIKA病毒E蛋白结构域III(Accession:KU955594.1)与人IgG1Fc(Accession:JN222933.1)核苷酸序列，两个序列间采用柔性肽(GGGS)₃连接，采用JCat软件对序列进行哺乳细胞表达进行密码子优化，得到SEQ.ID.NO.1，化学合成方法得到上述序列，在该序列5’端起始密码子前加入Nhe I酶切位点，3’端终止密码子后加入Mlu I酶切位点，将其克隆至商品化载体pMD19-T(Takara，lot No.D104A)中，重组载体命名为pMD19-ZDIII-hFc。

2、慢病毒重组载体的构建及检测

慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP的获得：将FUGW质粒用PacⅠ酶切后补平再用BamHⅠ酶切回收载体大片段；将pCDNA3.0质粒先用BglⅡ酶切后补平再用BamHⅠ酶切后回收CMV启动子，再用Roche ligation kit将上述回收的载体大片段和CMV启动子连接后得到慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP。

将上述慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP用Nhe I和MluⅠ酶切处理回收大片段，然后与经Nhe I和MluⅠ酶切回收的ZDⅢ-hFc基因在T4DNA连接酶作用下连接，转化stab3感受态细胞后涂布含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，用菌落PCR及Nhe I和MluⅠ酶切对其进行鉴定，鉴定的阳性质粒即为本实施例所需慢病毒重组载体，将其命名为pLV-CMV-EGFP-ZDⅢ-hFc。

上述FUGW质粒、pCDNA3.0质粒和Roche ligation kit均为市售。

上述含氨苄的LB平板，其培养基配方为100mL：胰化蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、氯化钠1g、琼脂1.5g，加蒸馏水溶解，高压灭菌20min，待液体冷却到55℃加入氨苄，摇匀后立刻倒板；所述氨苄浓度为100mg/mL，加入量为每100mL培养基加入100ul氨苄。

本实施例慢病毒重组载体的构建示意图如图1所示，提取的重组质粒经Nhe I和MluⅠ酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，发现有两条带，酶切产物电泳带型与预期结果一致(见图2)。

3、慢病毒包装及滴度检测

3.1、细胞铺板

细胞铺板采用本领域技术人员的常规操作，具体步骤如下所示：

倒掉HEK-293T细胞培养瓶中的培养上清，用1-3ml PBS洗涤一遍，吸净；加入1ml 0.25％的胰酶，室温作用1-2min；待细胞都变圆，加入2-3ml DMEM完全培养基把细胞吹打下来，收集到离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；用DMEM完全培养基将细胞沉淀充分重悬，使细胞形成单细胞悬液；

向100mm细胞培养皿加入10ml DMEM完全培养基，用细胞计数板进行细胞计数，每个皿约加入6×10⁶细胞，37℃、5％CO₂培养箱内培养过夜。

DMEM完全培养基的配方为：含10％FBS、100U/ml的青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM完全培养基(Corning cellgro,USA,lot number 10-013-CVR-500ml)。

细胞状态对于病毒包装至关重要，细胞生长良好的状态有利于病毒包装，因此需要保证良好的细胞状态。

3.2慢病毒包装及感染

所述慢病毒包装就是将之前制备的慢病毒重组载体pLV-CMV-EGFP-ZDⅢ-hFc与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚胎肾细胞HEK-293T，转染方法采用PEI(聚乙烯亚胺)方法，具体步骤如下所示。

3.2.1转染体系

所述PEI转染法为本领域技术人员的常规操作，其转染体系分为A液和B液，具体如下所示：

A液

PEI储存液 24μl；

1×HBS 补至1ml；

B液

上述PEI储存液的配方是：称取1.25mg PEI粉末溶解于50ml×HBS(pH7.4)中，0.2μm滤膜过滤，储存于4℃备用。

上述1×HBS的配方为：将8.76g NaCl溶解于900ml超纯水，加入20ml 1M的HEPES，调pH值到7.4，定容至1L，0.2μm滤膜过滤后储存于4℃备用。上述慢病毒包装系统质粒gag/pol、Rev、VSVG购自Invitrogen公司(货号：K4975-00)，这些包装质粒提供了病毒基因组mRNA包装成完整毒粒所必需的结构蛋白、聚合酶和包膜蛋白。

3.2.2转染

细胞铺板后第二天，待细胞融合度达到70％-90％时，将转染体系的A液加入到B液，充分混匀，室温静置20min后，轻轻滴加到100mm皿的细胞培养上清中，轻晃培养皿混匀，放37℃，5％CO₂孵箱中培养48h后收集上清液，然后再向细胞培养皿中加入10ml DMEM完全培养基，继续培养48h后收集上清液，合并两次上清液，然后3000rpm离心5min后去除细胞碎片，则得到所需病毒液。

将该病毒液取100μl用于检测病毒滴度，其余的分装后放于-80℃冰箱保存或用于后续的细胞感染。

3.3病毒滴度检测

病毒滴度检测采用RT-QPCR测定病毒滴度，其操作方法采用本领域技术人员的常规操作和所用试剂盒说明步骤即可，检测结果显示病毒滴度为1×10⁸copies/ml，说明病毒包装成功，能感染细胞并将基因插入到细胞基因组中。

3.4、细胞感染

将上述得到的病毒液感染HEK293-T细胞，具体步骤如下所示：

将生长状态良好的HEK293-T细胞消化计数后用DMEM完全培养基稀释至1×10⁵/mL，加入24孔板，500μL/孔，准备2个复孔，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；

在DMEM完全培养基中加入polybrene(聚凝胺)，制备含polybrene的培养基(培养基中Polybrene的终浓度为6-8μg/mL)；

将上述3.2.2制备的病毒液10μl加入到上述含polybrene的培养基中，使终体积为300μl并轻吹混匀，制备得到含病毒培养基；

将步骤1培养24h后的HEK293-T细胞的旧培养基倒掉，每个孔内加入300μl含病毒培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养。

4、基因稳定分泌表达细胞系的建立

培养到第3-5天后，将长满培养孔的细胞用胰酶消化后，用有限稀释法传代于96孔板中继续培养，15天后在倒置显微镜下观察每孔细胞的克隆数目；

挑选含有1个细胞集落(即1个细胞团块)的孔，将克隆细胞在24孔板中培养3d后，收集上清液，10倍浓缩后加入电泳上样缓冲液制离心后吸取上清进行SDS-PAGE电泳，转膜后采用5％脱脂奶(BioRad公司)封闭2h，采用抗Zika病毒多克隆抗体孵育过夜(美国Kerafast公司，1：10000稀释)，TBST洗涤3次，每次10min，孵育HRP标记的兔抗人二抗(天根生化科技(北京)有限公司，1：10000稀释)，37℃1h，之后曝光。

Western blotting结果如图3所示。

结果表明我们筛选得到的4个克隆都能表达Zika病毒E蛋白结构域Ⅲ与人源IgG1Fc融合蛋白，重组蛋白大小约为40kD，但表达量有差异，我们选取表达量最高的4号细胞克隆继续扩大培养后保存，并将其命名为HEK-293T-ZDⅢ-hFc，并且对其进行稳定性检测。

5、本发明重组细胞系的稳定性检测

5.1克隆细胞不同代次细胞的Western blotting鉴定

将上述筛选得到的重组细胞系HEK-293T-ZDⅢ-hFc正常传代并收集不同代次(第1、5、10、15、20，25，30，35代)细胞培养上清进行Western blotting鉴定，鉴定结果如图4所示，结果表明不同代次的细胞均能稳定表达目的蛋白。

5.2克隆细胞不同代次细胞的RT-PCR鉴定

根据本领域常规技术和相关试剂盒说明书，采用RT-PCR对重组细胞系HEK-293T-ZDⅢ-hFc第1、5、10、15、20，25，30，35代细胞进行目的基因的扩增后，结果如图5所示，重组细胞系HEK-293T-ZDⅢ-hFc的不同代次的细胞均能扩增出与理论大小一致的目的条带，表明目的基因已稳定融合于细胞基因组中，且遗传稳定。

从上述检测结果可以看出，本实施例确实获得能够稳定表达Zika病毒E蛋白结构域Ⅲ的重组细胞系HEK-293T-ZDⅢ-hFc。

实施例2(融合蛋白的纯化)

1、Zika病毒E蛋白结构域Ⅲ与人源IgG1Fc融合蛋白纯化

细胞培养上清经0.45μm滤膜过滤，rProtein A Sepharose^TM Fast Flow层析胶柱与BioLogic LP蛋白纯化仪正确连接后，用3倍柱床体积的上样缓冲液(50mM pH7.0Tris)，1ml/min平衡柱子，将预处理的样品以1ml/min的速度上样，结束后用上样缓冲液进行流洗，1ml/min，5倍柱床体积，随后用1M pH3.0甘氨酸洗脱抗体，同时用BioLogic LP蛋白纯化仪进行监测，当观察到基线上升，即出现洗脱峰时开始收集，并立即用1M，pH9.0的Tris-HCl调整洗脱液pH至7.0。收集洗脱液至洗脱峰回到基线后，继续用上样缓冲液平衡5-10倍柱床体积，流速调至1ml/min。再用20％乙醇平衡5倍柱床体积。

2、蛋白纯化分析

收集蛋白纯化各步留样进行Western blotting分析，方法同实施例1中方法。由图6可知，上样时所监测到第一个峰为非结合峰与第二个峰(目的蛋白峰)分离良好。Western blotting结果表明Zika病毒E蛋白结构域Ⅲ与人源IgG1Fc融合蛋白纯化条件成熟，纯化效率较高(见图7)。