本发明涉及一种检测原浆啤酒酵母的方法，目的在于从下面啤酒酵母中快速、方便、灵敏地检测出原浆啤酒酵母，属食品分析技术领域。
(二)
背景技术：
下面啤酒是我国主要的传统啤酒类型。但随着啤酒行业竞争的日趋激烈与消费者口味需求的多样化，越来越多的啤酒企业使用不同的啤酒酵母来生产风格各异的啤酒产品。原浆啤酒是近几年迅速崛起的新型啤酒产品，深受广大消费者青睐。然而对同时生产下面啤酒与原浆啤酒的企业而言，下面啤酒酵母与原浆啤酒酵母互为污染酵母。与下面啤酒酵母不同的是：原浆啤酒酵母发酵的啤酒具有典型的酵母发酵特征，如浓郁的水果香、酚香和酯香等。倘若下面啤酒被原浆啤酒酵母污染，后者的发酵特征就会在下面啤酒中呈现，导致下面啤酒出现杂味，并且严重影响下面啤酒的品质。如何及时准确的判断下面啤酒被原浆啤酒酵母污染的可能性，是啤酒生产者保证啤酒产品质量的有效手段。因此，研究快速检测原浆啤酒酵母的方法，及时对下面啤酒发酵过程中的潜在危害进行预警，对保障下面啤酒品质具有重要意义。
目前关于啤酒酿造中野生酵母的研究报道较多。例如吴文芳等早在1994年就介绍了啤酒中野生酵母的分类及危害，野生酵母的检测方法及对各方法的评价；林先军研究认为在麦芽浸出物、酵母浸出物、葡萄糖和蛋白胨(MYGP)的琼脂培养基中补充195mg/L的CuSO4制备的培养基可有效的选择性分离野生酵母，能从80％的污染样品中检测到野生酵母；并且这种培养基既能检测酿酒酵母属酵母，也能检测非酿酒酵母属野生酵母。所谓野生酵母，是指在啤酒酿造过程中出现的除培养酵母之外的所有酵母，威尔斯对野生酵母的定义则是：任何未经严密选用与控制的酵母，即为野生酵母。随着原浆啤酒产品的日益盛行，作为非野生酵母属原浆啤酒酵母的研究也引起研究者的广泛兴趣。但对下面啤酒酵母与原浆啤酒酵母交叉污染情况及其分离、鉴别手段的研究目前尚未见报道。
(三)
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种从下面啤酒酵母中快速检测原浆啤酒酵母的方法；发明人研究发现，原浆啤酒酵母的最高生长温度为36℃，且耐受30mg/L的结晶紫；而下面啤酒酵母在36℃条件下不生长，在含30mg/L结晶紫的培养基上也不生长；该方法适用于所有存在形式的下面啤酒酵母，如啤酒种酵母液、啤酒发酵液与回收酵母泥。
一种从下面啤酒酵母中快速检测原浆啤酒酵母的方法，是先将待测样品冰浴超声5～10min，快速除去样品中的CO2，并打散酵母细胞；然后取1mL超声处理后的样品(或超声处理后再经系列梯度稀释的样品)于9cm的平板培养皿中，倒入45～50℃的酵母氮源-葡萄糖-结晶紫-溴甲酚绿-琼脂培养基(YNB-GVBA培养基)，混匀；待YNB-GVBA培养基凝固后，36℃培养2～3d，观察YNB-GVBA培养基上的菌落生长情况；如果YNB-GVBA培养基上有菌落生成，且菌落周边由绿色变为黄色，表明下面啤酒酵母中混入有原浆啤酒酵母；如果培养基上没有菌落生成，则表明下面啤酒酵母中没有混入原浆啤酒酵母。
进一步的，所述YNB-GVBA培养基采用双料YNB-GVBA培养基，待测样品中原浆啤酒酵母的检出率可提高10倍。
所述YNB-GVBA培养基的制备方法为：先称取YNB培养基0.67g，葡萄糖2.0g，结晶紫与溴甲酚绿各3.0mg，琼脂1.8g，溶解到100mL的去离子水中，121℃灭菌15min，得到YNB-GVBA培养基。
所述双料YNB-GVBA培养基的配制方法为：将YNB-GVBA培养基中除去离子水外的其它组分按重量比加倍溶解到100mL去离子水中，121℃灭菌15min得到双料YNB-GVBA培养基。
本发明的有益效果是：
本发明针对下面啤酒酵母中可能混有原浆啤酒酵母，从而影响下面啤酒风味的问题提出，是一种快速、方便、灵敏的从下面啤酒酵母中检出原浆啤酒酵母的方法。
YNB-GVBA培养基价格便宜，制备方便，其中的原料YNB培养基来源广泛，可市购得到；冰浴超声5～10min即可快速有效的除去被测样品中的CO2并打散酵母细胞，适用于同时处理大量样品；采用30mg/L的结晶紫与36℃培养双重栅栏因子，可有效抑制下面啤酒酵母生长，测定方法的准确性高，适应性广；本发明同时适用于下面啤酒的种酵母液、发酵液和酵母泥的检测；下面啤酒酵母中原浆啤酒酵母的最低检出限为340个细胞/mL，采用双料培养基时，检出率可提高10倍，灵敏度更高；本发明方法的操作时间仅2～3d，便可实现对啤酒酵母交叉污染的早发现、早预防和早处理。另外，本发明的实施不需要增加额外的仪器设备，不需要专门的人员培训，应用性强，对保障啤酒品质、实现啤酒类型的多样化、安全性生产意义重大。
(四)具体实施方式
本实施例中YNB培养基可购自青岛海博生物技术有限公司。
实施例1由下面啤酒种酵母液中检出原浆啤酒酵母
1、原浆啤酒酵母-下面啤酒种酵母混合液的制备
将待检原浆啤酒酵母培养液冰浴超声5min，快速除去其中的CO2，并打散酵母细胞。用无菌吸管吸取打散酵母细胞后的啤酒酵母培养液1mL，沿管壁缓缓注入含9mL无菌生理盐水的试管中，漩涡振荡，混合均匀，制成10-1的样品匀液。再用无菌吸管吸取10-1的样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入含9mL无菌生理盐水的试管中，漩涡振荡，混合均匀，制成10-2的样品匀液。以此类推，分别制成10-3、10-4、10-5、10-6的原浆啤酒酵母稀释液。
将下面啤酒种酵母液冰浴超声5min，快速除去其中的CO2并打散酵母细胞。将打散的下面啤酒种酵母与原浆啤酒酵母按表1比例加入到无菌试管中，充分混匀，得到不同比例的酵母混合液。
表1原浆啤酒酵母与下面啤酒种酵母混合比例
注：下面啤酒种酵母液细胞浓度为4600万个细胞/mL(w/mL)；原浆啤酒酵母培养液细胞浓度为3400万个细胞/mL(w/mL)。w代表酵母数量“万个”。
2、检测
分别用无菌吸管吸取1mL酵母混合液于9cm的平板培养皿中，每个培养皿中倒入45℃的YNB-GVBA培养基20mL，充分混匀，静置凝固后36℃培养2d，检测结果如表1所示，即每毫升下面啤酒种酵母液中含有340个原浆啤酒酵母细胞数时便可被检出。
分别用无菌吸管吸取10mL酵母混合液于9cm的培养皿中，倒入50℃的YNB-GVBA双料培养基10mL，充分混匀，静置凝固后36℃培养2d，检测结果如表2所示(含单料培养基检测结果)。
表2原浆啤酒酵母与下面啤酒种酵母混合比例及检测结果
注：“+”代表检出；“-”代表未检出；双料培养基检测过程中，原浆啤酒酵母培养液细胞液浓度为4000万个细胞/mL(w/mL)。w代表酵母数量“万个”。
采用YNB-GVBA双料培养基时，下面啤酒种酵母液中原浆啤酒酵母的最低检出限则为40个细胞/mL，即每毫升下面啤酒种酵母液中含有40个原浆啤酒酵母细胞数时便可被检出。
实施例2由下面啤酒发酵液中检出原浆啤酒酵母
1、原浆啤酒酵母-下面啤酒发酵液混合液的制备
将待检原浆啤酒酵母培养液冰浴超声5min，快速除去其中的CO2，并打散酵母细胞。用无菌吸管吸取打散酵母细胞后的啤酒酵母培养液1mL，沿管壁缓缓注入含9mL无菌生理盐水的试管中，漩涡振荡，混合均匀，制成10-1的样品匀液。再用无菌吸管吸取10-1的样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入含9mL无菌生理盐水的试管中，漩涡振荡，混合均匀，制成10-2的样品匀液。以此类推，分别制成10-3、10-4、10-5、10-6的原浆啤酒酵母稀释液。
将下面啤酒发酵液冰浴超声10min，快速除去其中的CO2，并打散酵母细胞。将下面啤酒发酵液中打散的酵母细胞与原浆啤酒酵母按表3比例加入到无菌试管中，充分混匀，得到不同比例的酵母混合液。
表3原浆酵母与下面啤酒发酵液混合比例及检测结果
注：“+”代表检出，“-”代表未检出；本实施例测试过程中，原浆啤酒酵母培养液细胞浓度为390万个细胞/mL(w/mL)。w代表酵母数量“万个”。
2、检测
分别用无菌吸管吸取1mL、10mL酵母混合液于9cm的培养皿中。盛1mL酵母混合液的培养皿中倒入50℃的YNB-GVBA培养基20mL，充分混匀，静置凝固后36℃培养3d；盛10mL酵母混合液的培养皿中倒入50℃的YNB-GVBA双料培养基10mL，充分混匀，静置凝固后36℃培养3d，检测结果如表3所示。下面啤酒发酵液中原浆啤酒酵母的最低检出限为：
YNB-GVBA单料培养基中为390个细胞/mL，即每毫升下面啤酒发酵液中含有390个原浆啤酒酵母细胞数时便可在YNB-GVBA培养基中被检出；
YNB-GVBA双料培养基中为39个细胞/mL，即每毫升下面啤酒发酵液中含有39个原浆啤酒酵母细胞数时便可在YNB-GVBA双料培养基中被检出。
实施例3由下面啤酒回收酵母泥中检测原浆啤酒酵母
1、原浆啤酒酵母-下面啤酒回收酵母泥混合液的制备
将待检原浆啤酒酵母培养液冰浴超声10min，快速除去其中的CO2，并打散酵母细胞。用无菌吸管吸取打散酵母细胞后的啤酒酵母培养液1mL，沿管壁缓缓注入含9mL无菌生理盐水的试管中，漩涡振荡，混合均匀，制成10-1的样品匀液。再用无菌吸管吸取10-1的样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入含9mL无菌生理盐水的试管中，漩涡振荡，混合均匀，制成10-2的样品匀液。以此类推，分别制成10-3、10-4、10-5、10-6的原浆啤酒酵母稀释液。
将稀释10倍的下面啤酒回收酵母泥冰浴超声10min，快速除去其中的CO2，并打散酵母细胞。将稀释并打散酵母细胞后的下面啤酒回收酵母泥与原浆啤酒酵母按表4比例加入无菌试管中，充分混匀，得到不同比例的酵母混合液。
2、检测
分别用无菌吸管吸取1mL、10mL酵母混合液于9cm的培养皿中。盛1mL酵母混合液的培养皿中倒入50℃的YNB-GVBA培养基20mL，充分混匀，静置凝固后36℃培养3d；盛10mL酵母混合液的培养皿中倒入50℃的YNB-GVBA双料培养基10mL，充分混匀，静置凝固后36℃培养3d，检测结果如表4所示。下面啤酒发酵液中原浆啤酒酵母的最低检出限为：
YNB-GVBA单料培养基中为370个细胞/mL，即每毫升下面啤酒回收酵母泥中含有370个原浆啤酒酵母细胞数时便可在YNB-GVBA培养基中被检出；
YNB-GVBA双料培养基中为37个细胞/mL，即每毫升下面啤酒回收酵母泥中含有37个原浆啤酒酵母细胞数时便可在YNB-GVBA双料培养基中被检出。
表4原浆啤酒酵母与下面啤酒回收酵母泥混合比例及检测结果
注：“+”代表检出，“-”代表未检出；本实施例测试过程中，原浆啤酒酵母培养液细胞浓度为370万个细胞/mL(w/mL)。w代表酵母数量“万个”。