一种耐热精氨酸酶的基因表达序列和应用的制作方法

一种耐热精氨酸酶的基因表达序列和应用，属于基因工程和现代酶技术工程领域。

背景技术：

L-鸟氨酸是一种不参与蛋白质组成、含有两个-NH₂和一个-COOH的碱性氨基酸。L-鸟氨酸普遍存在于生物体内，是尿素循环的中间代谢产物，是瓜氨酸、L-精氨酸等多种氨基酸代谢的前体物质，对体内聚集的氨具有解毒作用，可促进氨态氮的排出，因而对人体肝脏细胞具有重要意义。近年来的研究还发现，L-鸟氨酸具有以下生理或物理化学功能：1、保肝护肝；2、减肥保健；3、促进伤口愈合及增强免疫力；4、抑制苦味。2002年12月日本厚生劳动省发布通告，将L-鸟氨酸作为食品原料来看待；在欧美L-鸟氨酸也被广泛用于提高基础代谢、预防肥胖以及增强肌肉合成的膳食补充剂。正是基于L-鸟氨酸所具有的诸多作用，目前对有关L-鸟氨酸的功能、制备及应用等各方面研究也悄然成为研究的热点领域。

目前用于L-鸟氨酸生产的方法主要有4种：发酵法、天然提取法、化学合成法和酶法。但L-鸟氨酸在自然界中存量较小，不足以大量提取；化学合成法也因合成所需的化学物质有毒且会产生消旋体而受到限制；发酵法生产虽然原料价格低廉，但对菌种的依赖性强，菌种有回复突变的问题，补料发酵和连续发酵控制起来难度较大，产量较低，发酵液中成分复杂，不利于L-鸟氨酸下游的分离纯化工作等。而利用精氨酸酶酶法水解L-精氨酸制备L-鸟氨酸就是一个经济实用且绿色环保的方法，因此对精氨酸酶研究的热点、广度及深度也进一步增强。

酶法是利用动植物或微生物体内的精氨酸酶作为催化剂，水解L-精氨酸生成L-鸟氨酸。精氨酸酶的来源不易，传统的酶法采用的精氨酸酶取自动物肝脏，但动物来源的精氨酸酶其热稳定性较差且酶活不高。生物酶法是目前工业上的热点方法，利用分子生物技术和基因工程技术，可以将外源的精氨酸酶基因表达于合适的载体，从而高效表达得到大量稳定性好且高活性的精氨酸酶。相比于传统动物来源精氨酸酶具有较强的竞争力。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种精氨酸酶。

本发明的另一目的在于提供一种精氨酸酶基因的调取方法。

本发明的另一目的在于提供一种精氨酸酶的编码基因。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述的精氨酸酶编码基因的重组表达载体、转基因细胞或基因重组菌。

本发明的又一目的在于提供上述精氨酸酶编码基因在表达精氨酸酶中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种鸟氨酸的制备方法。

本发明的技术方案：

本发明提供的精氨酸酶，其氨基酸序列的编码基因克隆自Rummeliibacillus pycnus SK31.001。本发明提供一种由实验室保藏的芽孢杆菌（Rummeliibacillus pycnus ）SK31.001（已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号 CCTCC NO：M 2011466，发明专利公开号：CN102433288A）。具有下述序列：

其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO：1。

其氨基酸序列为编码序列表中的SEQ ID NO：2。

一种耐热精氨酸酶的基因表达序列，对比不同微生物来源精氨酸酶基因，获得其保守氨基酸序列，并根据其氨基酸序列设计简并引物P1及P2，利用简并PCR，以Rummeliibacillus pycnus SK31.001基因组为模板获得部分精氨酸酶基因序列SEQ ID NO：3；再设计反向引物P3及P4，进行反向PCR；获得耐热精氨酸酶的基因表达序列SEQ ID NO：1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

部分精氨酸酶基因序列SEQ ID NO：3的获得：根据NCBI数据库中不同来源的精氨酸酶基因序列对比结果，找到保守序列：GVDMPSA， GNIHGM， GVGTPVI 和HLAMEML，并选取两段保守序列设计简并引物：

上游引物P1：5’-ggngtngaya tgggncc-3’，

下游引物P2：5’-acnggngtnc cnacncc-3’，

提取Rummeliibacillus pycnus SK31.001的总DNA，以其基因组为模板，扩增部分精氨酸酶基因序列，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，并TA克隆至pMD-19T质粒上，测序结果为序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

设计反向引物，扩增已知片段的外侧基因序列，引物设计如下：

上游引物P3：5’- tgcgcctaaa gtaaaacctg-3’，

下游引物P4： 5’- gaattgcact tggacccat-3’，

选取合适的内切酶Hind Ⅲ单切Rummeliibacillus pycnus SK31.001基因组，再利用T4链接酶环化单切的基因组片段，并以此作为反向PCR的模板，进行反向PCR扩增；扩增已知序列的外侧未知序列；

两者相结合得到精氨酸酶基因的完整序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

一种耐热精氨酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

所述的耐热精氨酸酶的基因表达序列的应用，其在大肠杆菌表达构建重组表达载体，将精氨酸酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到表达精氨酸酶的重组表达载体：所述的大肠杆菌表达载体优选为pET-28a（+），构建的重组表达质粒为pET-28a（+）-arg。

其在大肠杆菌表达，筛选得到表达精氨酸酶基因的重组菌株；所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21（DE3），构建的重组菌株为E.coliBL21（DE3）-pET-28a（+）-arg。

一种制备鸟氨酸的方法，是以精氨酸为底物，用所述的E.coli BL21（DE3）-pET-28a（+）-arg重组菌全细胞转化精氨酸生成鸟氨酸，反应底物浓度为200g/L，温度40℃，pH9.5，Mn²⁺浓度为1mM，100mL体系中加入0.3g湿菌体反应6h即得到95.4%转化率的鸟氨酸。

构建的重组质粒导入到大肠杆菌中进行高效表达，获得该基因表达的目的蛋白进行研究，确定其酶学性质。这一成功利用简并PCR与反向PCR调取精氨酸酶基因的技术尚属第一次报导。尚无文献检索到公开的文献和专利等利用该技术调取Rummeliibacillus pycnus精氨酸酶基因。这一DNA序列区别于已报道的其他精氨酸酶基因序列，且该基因编码的精氨酸酶在氨基酸序列大小、酶的分子大小、酶的最适温度及最适pH等方面都有所不同。因此可判断本发明属于一种新的发明。

从Rummeliibacillus pycnus中得到的精氨酸酶具有以下特征：

1、该精氨酸酶编码基因长度为906bp，编码301个氨基酸，亚基分子量约为34kDa；

2、该精氨酸酶的最适反应温度为80℃，适合反应的温度范围为60-85℃；

3、该精氨酸酶的最适反应pH为9.5，适合反应的pH范围为8.0-10.0；

4、二价金属浓度在1mM时，Mn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺和Mg²⁺对酶活有促进作用，其中Mn²⁺促进作用最明显，而Cu²⁺和Ba²⁺对酶活有抑制作用。

本发明的有益效果：本发明所述的精氨酸酶基因调取方法成功将目的基因从未知基因组中提取出来，为其他未知精氨酸酶基因的获取提供了新思路；本发明所述的精氨酸酶基因属于首次报道发现，尚无文献检索到公开的文献和专利等利用该技术调取Rummeliibacillus pycnus精氨酸酶基因；本发明所述重组表达获得的精氨酸酶最适温度在80℃，具有良好的耐热性；本发明所述的精氨酸酶酶法转化精氨酸生成鸟氨酸，以最优选200g/L的精氨酸底物浓度，在最佳条件先反应6h，即可得到95.4%转化率的鸟氨酸，反应速度快，从而可以减少设备的占用率和提高生产率，有利于降低成本；本发明所述的精氨酸酶在天然Rummeliibacillus pycnus SK31.001中含量低，应用基因工程技术，将目的基因异源表达于大肠杆菌体系中可使酶活力提高数千倍，有助于鸟氨酸的生产。

附图说明

图1. Rummeliibacillus pycnus SK31.001精氨酸酶基因调取策略示意图。

图2.Rummeliibacillus pycnus SK31.001精氨酸酶基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。1、精氨酸酶基因片段；M、DNA marker。

图3. pH对精氨酸酶的影响。

图4.温度对精氨酸酶的影响。

图5. 全细胞转化生产鸟氨酸反应时间与产物底物浓度关系曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不限制本发明的范围。

实施例1：Rummeliibacillus pycnus精氨酸酶编码基因的核苷酸序列调取

1.因Rummeliibacillus pycnus其已知报导的序列仅为其16sRNA序列，进而其精氨酸酶编码基因序列的调取策略如图1所示。根据NCBI数据库中不同来源的精氨酸酶基因序列对比结果，找到保守序列：GVDMPSA，GNIHGM，GVGTPVI 和HLAMEML，并选取两段保守序列设计简并引物。引物设计如下：

上游引物P1：5’-ggngtngaya tgggncc-3’，

下游引物P2：5’-acnggngtnc cnacncc-3’，

提取Rummeliibacillus pycnus SK31.001的总DNA，以其基因组为模板，扩增部分精氨酸酶基因序列，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，并TA克隆至pMD-19T（simple）质粒上，并送至上海生物工程技术服务有限公司进行测序分析。测序结果为序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

2. 根据SEQ ID NO：3所示的部分核苷酸序列，设计反向引物，扩增已知片段的外侧基因序列。引物设计如下：

上游引物P3：5’- tgcgcctaaa gtaaaacctg-3’，

下游引物P4：5’- gaattgcact tggacccat-3’，

选择合适的内切酶（Hind Ⅲ），将Rummeliibacillus pycnus SK31.001的基因组切断，并用T4连接酶将上述切断的基因片段环化连接，并以此作为反向PCR的模板。琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，并TA克隆至pMD-19T（simple）质粒上，并送至上海生物工程技术服务有限公司进行测序分析。测序结果与SEQ ID NO：3序列结合为序列表中SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

3. 分析SEQ ID NO：4核苷酸序列，推测出精氨酸酶基因编码的完整序列，如序列表中SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例2：Rummeliibacillus pycnus精氨酸酶编码基因的核苷酸序列克隆表达

1.提取Rummeliibacillus pycnus SK31.001的总DNA，以其基因组为模板，使用特异性引物P5（加入BamHⅠ酶切位点）和P6（加入XhoⅠ酶切位点），经PCR扩增得到完整的精氨酸酶基因。引物设计如下：

上游引物P5：5’-cgcggatcca tggaatcatt aaaaatatca atga-3’，

下游引物P6：5’-ccgctcgagt taaactaaag tctcaccaaa taa-3’，

琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，所得电泳图如图2所示。

2. 将电泳分离的特异性目的片段进行切胶，然后利用胶回收试剂盒回收目的片段PCR产物，经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a（+）在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a（+）-arg。

3. 将重组质粒pET-28a（+）-arg转化至感受态E.coli BL21（DE3）中，涂布在含有50μg/L卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃培养过夜，得到初步阳性菌落。挑取阳性克隆菌落于5mL LB液体培养基（含卡那霉素）中，37℃摇床振荡培养12h。提取质粒，限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切验证，根据电泳结果判断是否为具有目的基因片段的质粒，并将确定的质粒送去上海生物工程有限公司测序。目的基因测序结果为SEQ ID NO：1，编码氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

实施例3：Rummeliibacillus pycnus精氨酸酶的异源表达和性质测定

1.将重组质粒pET-28a（+）-arg转化至感受态E.coli BL21（DE3）中，涂布在含有50μg/L卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃培养过夜，得到初步阳性菌落。

2. 挑取阳性克隆菌落于5mL LB液体培养基（含卡那霉素）中，37℃摇床振荡培养12h作为种子液。以1%的添加量转接至LB发酵培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.4mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG））并在28℃下进行诱导，12h后收集菌体。4℃、8000rpm离心弃上清。

3.收集的菌体用Tris缓冲液（pH7.0）重新悬浮，并超声破碎细胞，4℃、 10000rpm离心，取上清即得到精氨酸酶的粗酶液。

4.底物浓度为100mM，精氨酸酶浓度为0.06μM，反应温度为80℃，反应时间10min，在pH5.0-10.0间进行反应并加入接触媒氯化锰（1mM）。测定精氨酸酶最适pH。结果表明重组精氨酸酶最适pH范围为8.0-10.0（图3）。

5.底物浓度为100mM，精氨酸酶浓度为0.06μmol，pH9.5，反应时间10min，在30-90℃间进行反应并加入接触媒氯化锰（1mM）。测定精氨酸酶最适温度。结果表明重组精氨酸酶适于反应的温度范围为60-85℃（图4）。

实施例4：全细胞反应转化生产L-鸟氨酸

100mL反应体系中：精氨酸底物浓度200g/L，盐酸调节pH至9.5，接触媒氯化锰至终浓度1mM，反应温度为40℃，加入实施例3中发酵得到的湿菌体0.3g。酶反应进行中在各时间点测定底物与产物的量并记录。发现该全细胞转化具有高效的L-鸟氨酸合成能力，见图5。在200 g/L底物浓度的生产中，反应6h即可得到95.4%摩尔转化的L-鸟氨酸产物。

SEQ ID NO：1

atggaatcat taaaaatatc aatgattggg gttcctatgg atatggggca gttacgcaga 60

ggtgttgata tgggtccaag tgcaattcgc tatgctggcg cggttgaacg tttaataaat 120

attggtcata cagtaataga tgatggggat atctatattg accattcaaa aaaagaaagt 180

tctacaaatt cagcattaag aaatttagag gcagttattg aagcaaatac taagttagct 240

caaaaagttc atgaaatagt agagaaagga agattccctt tagtactggg tggtgatcat 300

agtattgcga taggtacgtt agctggaatt tcagatcact acgaaaatct aggtgttatt 360

tggtatgatg ctcatgcaga tatgaataca agtgaaacat caccctcagg aaatattcat 420

ggcatgccat tagctgttag catgggtatt ggtgatgaag gtttggtaaa tattaaagga 480

tatgcgccta aagtaaaacc tgagaatatt gttattatcg gtgcacgttc tattgatcag 540

ggtgagaagc aattaattcg tgaaaaaggt ataaaagtat attcaatgca tgaaattgat 600

cgtctaggca tgactgatgt tatacaagat gcaattattt atttaaaagg tcaaaatgta 660

gatggcgttc atttatctct agatttagat ggcattgatc cgatatatac tccaggagta 720

ggaacaccag tgccaggtgg aataacatac agagaaagtc atctagccat ggaaatgttg 780

caagaatcag gtttagttac atctgcagaa tttgtagaag tcaatccaat acttgatgaa 840

agaaataaaa cagctgacgt agcagttgct ttaatgggtt cattatttgg tgagacttta 900

gtttaa 906

SEQ ID NO：2

MET Glu Ser Leu Lys Ile Ser MET Ile Gly Val Pro MET Asp MET

5 10 15

Gly Gln Leu Arg Arg Gly Val Asp MET Gly Pro Ser Ala Ile Arg

20 25 30

Tyr Ala Gly Ala Val Glu Arg Leu Ile Asn Ile Gly His Thr Val

35 40 45

Ile Asp Asp Gly Asp Ile Tyr Ile Asp His Ser Lys Lys Glu Ser

50 55 60

Ser Thr Asn Ser Ala Leu Arg Asn Leu Glu Ala Val Ile Glu Ala

65 70 75

Asn Thr Lys Leu Ala Gln Lys Val His Glu Ile Val Glu Lys Gly

80 85 90

Arg Phe Pro Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Ile Ala Ile Gly

95 100 105

Thr Leu Ala Gly Ile Ser Asp His Tyr Glu Asn Leu Gly Val Ile

110 115 120

Trp Tyr Asp Ala His Ala Asp MET Asn Thr Ser Glu Thr Ser Pro

125 130 135

Ser Gly Asn Ile His Gly MET Pro Leu Ala Val Ser MET Gly Ile

140 145 150

Gly Asp Glu Gly Leu Val Asn Ile Lys Gly Tyr Ala Pro Lys Val

155 160 165

Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Ile Gly Ala Arg Ser Ile Asp Gln

170 175 180

Gly Glu Lys Gln Leu Ile Arg Glu Lys Gly Ile Lys Val Tyr Ser

185 190 195

MET His Glu Ile Asp Arg Leu Gly MET Thr Asp Val Ile Gln Asp

200 205 210

Ala Ile Ile Tyr Leu Lys Gly Gln Asn Val Asp Gly Val His Leu

215 220 225

Ser Leu Asp Leu Asp Gly Ile Asp Pro Ile Tyr Thr Pro Gly Val

230 235 240

Gly Thr Pro Val Pro Gly Gly Ile Thr Tyr Arg Glu Ser His Leu

245 250 255

Ala MET Glu MET Leu Gln Glu Ser Gly Leu Val Thr Ser Ala Glu

260 265 270

Phe Val Glu Val Asn Pro Ile Leu Asp Glu Arg Asn Lys Thr Ala

275 280 285

Asp Val Ala Val Ala Leu MET Gly Ser Leu Phe Gly Glu Thr Leu

290 295 300

Val ***

301

SEQ ID NO：3

atgggtccaa gtgcaattcg ctatgctggc gcggttgaac gtttaataaa tattggtcat 60

acagtaatag atgatgggga tatctatatt gaccattcaa aaaaagaaag ttctacaaat 120

tcagcattaa gaaatttaga ggcagttatt gaagcaaata ctaagttagc tcaaaaagtt 180

catgaaatag tagagaaagg aagattccct ttagtactgg gtggtgatca tagtattgcg 240

ataggtacgt tagctggaat ttcagatcac tacgaaaatc taggtgttat ttggtatgat 300

gctcatgcag atatgaatac aagtgaaaca tcaccctcag gaaatattca tggcatgcca 360

ttagctgtta gcatgggtat tggtgatgaa ggtttggtaa atattaaagg atatgcgcct 420

aaagtaaaac ctg 433

SEQ ID NO：4

tttacctgta agtgattaga attgatccct tggtttctat ttcttattta gtaagtaaaa 60

taatctcttt cttacttctt ttgtataaaa agggttagtc atgttaaaag aatttagaat 120

tgaataaaaa tacagaaaaa tgataagttg agccatgagt attcctgccg ttacaataga 180

attagctgac aaagggggta tcaattcatg gaatcattaa aaatatcaat gattggggtt 240

cctatggata tggggcagtt acgcagaggt gttgatatgg gtccaagtgc aattcgctat 300

gctggcgcgg ttgaacgttt aataaatatt ggtcatacag taatagatga tggggatatc 360

tatattgacc attcaaaaaa agaaagttct acaaattcag cattaagaaa tttagaggca 420

gttattgaag caaatactaa gttagctcaa aaagttcatg aaatagtaga gaaaggaaga 480

ttccctttag tactgggtgg tgatcatagt attgcgatag gtacgttagc tggaatttca 540

gatcactacg aaaatctagg tgttatttgg tatgatgctc atgcagatat gaatacaagt 600

gaaacatcac cctcaggaaa tattcatggc atgccattag ctgttagcat gggtattggt 660

gatgaaggtt tggtaaatat taaaggatat gcgcctaaag taaaacctga gaatattgtt 720

attatcggtg cacgttctat tgatcagggt gagaagcaat taattcgtga aaaaggtata 780

aaagtatatt caatgcatga aattgatcgt ctaggcatga ctgatgttat acaagatgca 840

attatttatt taaaaggtca aaatgtagat ggcgttcatt tatctctaga tttagatggc 900

attgatccga tatatactcc aggagtagga acaccagtgc caggtggaat aacatacaga 960

gaaagtcatc tagccatgga aatgttgcaa gaatcaggtt tagttacatc tgcagaattt 1020

gtagaagtca atccaatact tgatgaaaga aataaaacag ctgacgtagc agttgcttta 1080

atgggttcat tatttggtga gactttagtt taaaaagaat gagcggtttc cctgttttat 1140

atctccgact gtagataaac tcgaagaaaa tagagtttat ctacagtttt tttctttaaa 1200

agatataaat aagaaaggtg attatagcta tgatagatac tttttgcgcg cagtgtttat 1260

taattctccg gtagccttaa tcaggtgata cataattatt tcaattatga tgaagtattt 1320

tctcttttaa tctatttttt tatattttac atgaatgtgt ataaaatgat aaaagttgta 1380

aggcaaaatt ggtataataa atataatatc ataatttaaa aaat 1424