本发明涉及中药材基因组DNA提取领域，具体涉及一种快速提取哈蟆油基因组DNA的方法、试剂盒及其应用。
背景技术：
：中药鉴定是研究中药品种、质量，制定中药标准，寻找和扩大药源的前提和基础。中药四大传统鉴定方法为基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。传统鉴定方法的理论基础建立于分类群的性状特征分析，这些性状特征是与物种生长发育阶段和环境紧密相关的表现型，易受主观和客观因素影响。而基因组DNA序列是物种的遗传本质特征，是生物的不可变“身份证”，这为动植物分类和鉴定提供了本质依据。DNA条形码(DNAbarcoding)技术是通过PCR技术扩增基因组序列中一段通用DNA片段，对PCR扩增的通用DNA片段进行比较分析完成物种快速、准确的识别和鉴定，在物种鉴定方面显示了广阔的应用前景。目前，利用COI序列对动物类药材进行鉴定已经取得了广泛的成功。但中国药典动物药材哈蟆油样本为不新鲜的干材样本，富含黏液质、胶质和半纤维素类等物质，使用现有商品DNA提取试剂盒提取哈蟆油DNA时，在加入裂解液后哈蟆油药材高度膨胀，膨胀度高达55倍以上，水浴离心后无上清液或极少上清液，无法进行后续哈蟆油药材DNA提取步骤，不利于后续的DNA条形码鉴定等工作。因此，本领域技术人员致力于开发一种快速提取哈蟆油基因组DNA的方法，从而为该药材的DNA条形码鉴定及其他应用提供良好的基础。技术实现要素：有鉴于现有技术中哈蟆油基因组DNA提取时哈蟆油药材的高度膨胀，难以快速有效提取基因组DNA的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种快速提取哈蟆油基因组DNA的方法。为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种快速提取哈蟆油基因组DNA的方法，该方法包括以下步骤：1)取哈蟆油样品，加入Chelex-100和蛋白酶K，先水浴保温，后高温终止，进行细胞裂解，离心后获得第一上清液；其中，Chelex-100用于螯合所述哈蟆油样品中的非核酸有机物和使蛋白变性便于蛋白酶K进行酶解，蛋白酶K用于消化所述哈蟆油样品中的蛋白质；2)在第一上清液中加入酚/氯仿/异戊醇，去除残留的脂类和蛋白质；3)利用异丙醇或无水乙醇沉淀DNA。优选地，Chelex-100的质量体积比为5％～10％，蛋白酶K的浓度为10～20mg/mL。进一步地，上述哈蟆油样品为干燥哈蟆油药材。进一步地，步骤1)进一步包括，在加入Chelex-100和蛋白酶K之后，对该哈蟆油样品进行研磨粉碎。进一步地，步骤1)中的水浴保温为54℃～58℃保温25～35分钟；高温终止为在煮沸的条件下保温5～10分钟，以使细胞膜破裂，并阻止所述哈蟆油样品的膨胀吸水。优选地，水浴保温为56℃保温30分钟；高温保温为在煮沸条件下保温8分钟。进一步地，在第一上清液加水补足体积至650～750μl，然后加入等体积的步骤2)中所述酚/氯仿/异戊醇，并剧烈振荡，离心后获得第二上清液；其中所述酚/氯仿/异戊醇的体积比为酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1。优选地，在第一上清液加水补足体积至700μl进一步地，步骤2)还包括在所述第二上清液中，加入等体积氯仿/异戊醇，并剧烈振荡，离心后获得第三上清液；其中氯仿/异戊醇的体积比为氯仿：异戊醇＝24:1。本发明的第二方面提供了一种快速提取哈蟆油基因组DNA的提取试剂盒，该试剂盒至少包括：含Chelex-100和蛋白酶K的裂解液；含酚、氯仿和异戊醇的杂质去除液。进一步地，裂解液中Chelex-100的质量体积比为5％～10％，蛋白酶K的浓度为10～20mg/mL。进一步地，该提取试剂盒还包括3mol/LpH5.2的乙酸钠，pH8.0的TE缓冲液以及研磨杵。本发明第三方面提供了上述快速提取哈蟆油基因组DNA的方法或上述快速提取哈蟆油基因组DNA的试剂盒在使用DNA条形码技术鉴定哈蟆油中的应用。本发明的优势在于，实现对干燥哈蟆油药材中基因组DNA的快速有效抽提。其中，利用蛋白酶K消化哈蟆油药材中的蛋白质；利用Chelex-100良好的金属离子选择性和较强的结合力，螯合非核酸有机物，同时通过煮沸破裂细胞膜，并使非核酸有机物变性，避免了哈蟆油裂解时的高度膨胀对后续DNA提取的影响。之后通过离心即可除去Chelex颗粒，从而将蛋白等杂质与DNA分离。联合后续的杂质去除液去除样本中的脂肪组织，进一步减少了脂肪和蛋白质对后续基因组DNA抽提的影响。使用本发明的DNA抽提方法，实现了对干燥哈蟆油困难中药材样本基因组DNA的快速释放和高效纯化。利用抽提获得的DNA，能实现DNA条形码鉴定技术100％的扩增成功率，这为DNA条形码技术得到更为广泛的应用提供了良好的基础。附图说明图1是采用本发明实施例2中提取获得的DNA进行PCR扩增检测后的电泳图。其中，CK为PCR的阴性对照。具体实施方式以下将结合实施例对本发明作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本发明的保护范围。实施例1干燥哈蟆油基因组DNA提取方法确立快速提取哈蟆油药材基因组DNA的标准方法，具体提取方法为：1.利用Chelex-100和蛋白酶K为裂解液，对干燥哈蟆油样本进行裂解。2.使用研磨杵反复研磨，至无明显颗粒，混匀。3.进行水浴保温，使蛋白酶K发挥消化作用。4.在煮沸条件下保温，使细胞裂解，同时在Chelex-100对非核酸有机物进行螯和作用下，防止干燥哈蟆油样品的吸水膨胀。5.离心取上清液，并使用ddH2O补充上清液体积，防止上清液太少，无法更好的完成后续抽提步骤。6.加入杂质去除液酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，振荡混匀后离心获取上清液。7.上清液再加入氯仿/异戊醇(24:1)，振荡混匀后离心获取上清液，从而去除残留的酚。8.上清液加入乙酸钠混匀，再加入2～2.5倍体积冰冷的无水乙醇混匀，冷藏，沉淀DNA。该步骤还可以采用等体积的异戊醇沉淀DNA。9.离心获得沉淀，干燥后加入TE缓冲液或ddH2O溶解，即获得基因组DNA。其中，利用十字交叉法确定最优Chelex100浓度、最优干燥哈蟆油称样量、最优水浴保温时间、最优煮沸保温时间。具体地，比较了不同Chelex100浓度，1％，3％，5％，7％，9％，10％；不同哈蟆油称样量，1mg，5mg,10mg,20mg,30mg；不同的水浴保温时间：10min，30min，1h，2h，4h，8h；不同的煮沸时间：2min，4min，6min，8min，10min。最终确定了最优Chelex100浓度为5％、最优干燥哈蟆油称样量为5mg、最优水浴保温时间为30min、最优煮沸保温时间8min。实施例2大样本验证为了验证实施例1中确定的干燥哈蟆油基因组DNA提取方法、试剂组成及浓度的普遍有效性，利用多种哈蟆油样本，进行验证。具体为：1)实现对不同产地(黑龙江省、吉林省和辽宁省)的哈蟆油药材和中国药品生物制品检定所的标准对照哈蟆油药材进行快速DNA提取。2)实现对不同商品规格(线油和块油)的哈蟆油药材进行快速DNA提取。1.取哈蟆油药材约5mg，加入含400μl5％Chelex-100和4μl蛋白酶K(20mg/mL)的裂解液。其中，使用的干燥哈蟆油药材分别为：取材地点为黑龙江的样品：C1、C2、C3；其中C1、C2为线油，C3为块油；取材地点为吉林的样品：C4、C5、C6；其中C4、C5为线油，C6为块油；取材地点为辽宁的样品：C7、C8、C9；其中C7、C8为线油，C9位块油；中国药品生物制品检定所的标准对照哈蟆油药材：CB，为粉末。2.使用研磨杵反复研磨30sec，至无明显颗粒，混匀。3.56℃保温30min，震荡10sec。4.100℃保温8min，震荡10sec。5.14000rpm/min离心3min，取上清，并使用ddH2O补充体积至700μl。6.加入等体积杂质去除液酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，在涡旋混合器上剧烈振荡混匀30sec，室温下以最高速度离心5min。7.小心将上清液转移至一新的离心管，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，在涡旋混合器上剧烈振荡混匀30sec，室温下以最高速度离心5min。8.小心将上清液转移至一新的离心管，加入1/10体积的3mol/LPH5.2的乙酸钠，在涡旋混合器上稍加振荡或用手指轻弹离心管壁几次使之混匀。9.加入2～2.5倍体积冰冷的无水乙醇或等体积异丙醇，在涡旋混合器上振荡混匀，冰浴5min，室温下以最高速度离心5min。10.弃去上清，加入1ml预冷的70％乙醇洗涤沉淀1～2次。11.沉淀在真空干燥器或者真空旋转蒸发器中干燥，或者小心吸去上清夜，将离心管倒置于一张纸上，常温自然干燥。12.加入50μlTE缓冲液(PH8.0)或者50μlddH2O溶解，在4℃或-20℃保存。DNA的浓度(OD值)及纯度(OD260/280)如表1所示：表1干燥哈蟆油样品提取DNA的浓度(OD值)及纯度(OD260/280)样本号称样量(mg)OD值OD260/OD280C15.26.61.92C25.45.61.49C35.73.91.43C44.68.12.1C55.59.41.88C65.13.21.89C74.63.31.87C84.95.21.8C94.93.42.23CB5.66.21.81由此可见，利用上述方法及相关试剂抽提获得的DNA，满足进行进一步的实验或分析研究的要求。实施例3快速提取哈蟆油基因组DNA的试剂盒该试剂盒至少包括以下成分：1.裂解液：含Chelex-100和蛋白酶K，Chelex-100的浓度为5％～10％，蛋白酶K浓度为10～20mg/mL；2.杂质去除液：酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，用于去除哈蟆油样品中的脂肪组织和蛋白等。此外，该试剂盒中还可以包括TE等常规DNA提取需要的试剂。若有需要，还可以包括研磨杵。实施例4采用实施例2中提取的哈蟆油基因组DNA进行PCR扩增检测。配制PCR体系，其中模版为实施例2中提取获得DNA。运行PCR扩增程序。PCR产物进行DNA电泳检测，结果如图1所示，提取的所有样品都扩增出了条带，并且条带明亮，说明抽提获得的DNA适用于进行后续的PCR扩增，为进一步地研究提供了基础。当前第1页1 2 3