发明领域本申请大体涉及生物
技术领域：
，具体而言，本申请涉及用于纯化gp96蛋白/gp96蛋白-多肽复合体的工具和方法，以及所获得的纯化的gp96蛋白/gp96蛋白-多肽复合体的用途。发明背景gp96蛋白属于热休克蛋白90家族，是内质网中最丰富的蛋白质之一，在细胞内发挥着分子伴侣的作用。在天然免疫中，gp96通过与toll样受体等相互作用刺激抗原递呈细胞产生各种细胞因子激活免疫系统。而在获得性免疫中，gp96-抗原肽复合体通过抗原交叉将抗原肽呈递给mhc-i类分子，诱发机体抗原特异性细胞毒性t细胞免疫应答，清除病原物感染和肿瘤。近年来的研究还发现gp96具有免疫佐剂的功能。因而，gp96蛋白是一类十分重要的蛋白分子，在机体的免疫中发挥重要作用。获得纯度较高的gp96蛋白和gp96蛋白-多肽复合体有助于更好地研究和利用该蛋白及其形成的复合体。因此gp96蛋白的纯化，特别是gp96蛋白-多肽复合体的纯化具有重要意义。当前用于蛋白纯化的主要技术有透析、超滤、沉淀、盐析、离子交换、亲和层析、电泳和吸附分离等。然而这些纯化技术都不能特异性纯化gp96蛋白，利用这些纯化方法纯化后的蛋白存在一定量的杂蛋白。如果用仅与gp96蛋白特异性结合的物质作为用于gp96蛋白亲和纯化的载体，则可大大提高纯化的gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体的纯度。可以利用此类纯化手段纯化gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体，以更好地研究和应用gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体。发明概述第一方面，本发明提供了纯化gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体的亲和树脂，其包含共价连接的生物素化的gp96-scfv蛋白和链霉亲和素树脂。第二方面，本发明提供了纯化gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体的亲和层析柱，其装填共价连接有生物素化的gp96-scfv蛋白的链霉亲和素树脂。第三方面，本发明提供了gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体纯化试剂盒，其包含第一方面的亲和树脂或第二方面的亲和层析柱。在一些实施方案中，gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体纯化试剂盒还包含用于蛋白纯化的平衡液、洗脱液和透析液中的至少一种。第四方面，本发明提供了制备用于纯化gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体的亲和树脂的方法，其包括下述步骤：(1)重组表达含有纯化标签、gp96-scfv和生物素化标签的融合蛋白；(2)利用所述纯化标签纯化所述融合蛋白；(3)将步骤(2)中得到的融合蛋白生物素化；以及(4)将步骤(3)中得到的生物素化的融合蛋白与链霉亲和素树脂连接。在一些实施方案中，步骤(2)包括在纯化后从所述融合蛋白切除所述纯化标签。第五方面，本发明提供了纯化gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体的方法，包括将包含gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体的样品与第一方面所述的亲和树脂接触。在一些实施方案中，样品来源于哺乳动物组织或细胞。在一些实施方案中，样品来源于个体的肿瘤组织、非肿瘤病理组织、血液样本中的细胞，或体外培养的被病原体感染的哺乳动物细胞或人细胞。第六方面，本发明提供了利用第五方面所述的方法获得的gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体。第七方面，提供了利用第五方面所述的方法获得的gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体在自身细胞变异、因外源性病原体感染以及自身免疫疾病的治疗和预防中的用途。附图简要说明图1a为切除gst标签并且生物素化的gp96-scfv蛋白与gp96抗原结合的western印迹结果，泳道1为标准蛋白质；泳道2为western印迹结果。图1b为阳性对照、阴性对照与gp96抗原结合的western印迹结果，泳道1为标准蛋白质；泳道2为阳性对照western印迹结果，其中阳性对照为商购的gp96一抗；泳道3为阴性对照western印迹结果，其中阴性对照为鼠源gst一抗。图2为生物素化的gp96-scfv蛋白与链霉亲和素树脂结合后的gp96蛋白亲和树脂及上清的sds-page蛋白凝胶电泳图。其中泳道1为标准蛋白质；泳道2为链霉亲合树脂与生物素化的gp96-scfv的结合；泳道3为游离的生物素化的gp96-scfv蛋白。其中约31kd处的蛋白为目的蛋白，其余条带为链霉亲合素树脂。图3为显示用制备的gp96蛋白亲和树脂纯化gp96蛋白的结果的sds-page蛋白凝胶电泳图。其中泳道1为收集的gp96；泳道2为标准蛋白质。发明详述本申请的发明人通过探索和研究，开发出了用于纯化gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体的新的工具和方法，为gp96蛋白纯化提供了新的技术路线。在第一方面，本发明提供了纯化gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体的亲和树脂，其包含共价连接的生物素化的gp96-scfv蛋白和链霉亲和素树脂。本领域中所周知，gp96蛋白属于热休克蛋白90家族，在细胞内发挥着分子伴侣的作用。其能够通过与toll样受体等相互作用刺激抗原递呈细胞产生各种细胞因子激活免疫系统。此外，gp96能够与不同的抗原肽结合而形成本申请所述的“gp96蛋白-多肽复合体”，该复合体能够诱发机体抗原特异性细胞毒性t细胞免疫应答，清除病原物感染和肿瘤。单链可变区片段(scfv,single-chainfragmentvariable)是由大约10-25个氨基酸短肽相连的免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区的融合蛋白。尽管移除了恒定区，其仍保留了原免疫球蛋白的特异性。因此，本申请提供的gp96蛋白的scfv能够特异性结合gp96蛋白，从而达到特异性纯化gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体的目的。生物素-亲和素系统是70年代末发展起来的一种新型的生物反应放大系统，被广泛应用于医学各领域。但是由于亲和素带有一个糖链侧链，导致容易与细胞表面的多糖发生非特异性亲和。链霉亲和素是由阿维丁链霉菌(streptomycesavidinii)分泌的一种蛋白质，其由4条相同的肽链组成，每条肽链都能结合一个生物素，并且不带任何糖基，因而链霉亲和素的非特异性结合远低于亲和素。不为任何理论所束缚，本申请中的生物素-链霉亲和素系统与亲和层析方法的联合使用大大提高了纯化的蛋白质的纯度。第二方面，本发明提供了纯化gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体的亲和层析柱，其装填共价连接有生物素化的gp96-scfv蛋白的链霉亲和素树脂。第三方面，本发明提供了gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体纯化试剂盒，其包含第一方面的亲和树脂或第二方面的亲和层析柱。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于蛋白纯化的平衡液、洗脱液和透析液中的至少一种。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于配制平衡液、洗脱液和透析液中的至少一种的固体成分。第四方面，本发明提供了制备用于纯化gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体的亲和树脂的方法，其包括下述步骤：(1)重组表达含有纯化标签、gp96-scfv和生物素化标签的融合蛋白；(2)利用所述纯化标签纯化所述融合蛋白；(3)将步骤(2)中得到的融合蛋白生物素化；以及(4)将步骤(3)中得到的生物素化的融合蛋白与链霉亲和素树脂连接。融合蛋白的构建和重组表达是本领域中已知的技术。简单而言，通常可以包括重组表达载体的构建和选择、目标序列(包含gp96-scfv的序列)的克隆和插入、向宿主细胞的转化、阳性转化株的筛选以及融合蛋白的表达和分离等。纯化标签和/或生物素化标签可以为目标序列的一部分，即，与目的蛋白共同连入表达载体。或者，纯化标签和/或生物素化标签可以存在于原始的表达载体中。具有纯化标签或其他标签(例如选择标记标签)的商业化表达载体能容易地购买到并且有很多选择，例如本申请实施例中使用的pgex-6p-1。在一些实施方案中，将编码gp96-scfv和生物素化标签的融合核酸分子连接至含有纯化标签编码序列的载体，所述融合核酸分子编码的氨基酸序列为qvqlvqsgaevkkpgatvkisckvsgytftdyymhwvqqapgkglewmglvdpedgetiyaekfqgrvtitadtstdtaymelsslrsedtavyycarmpvsqmphwgqgtlvtvsr/ggggsggggsggggs/seltqdpavsvalgqtvritcqgdslrsyyaswyqqkpgqapvlviygknnrpsgipdrfsgsssgntasltitgaqaedeadyycnsrdssgnhvvfgggtkltvlg/ggggsggggsggggs/glndifeaqkiewh(氨基酸序列参见seqidno:1，编码序列参见seqidno:4)，其中用“/”示出了序列的各个组成部分，具体为：重链部分/连接子/轻链部分/连接子/生物素化标签，其中重链部分的genbank登录号为cac20420，轻链部分的genbank登录号为s19663。本领域中已知的蛋白纯化用标签有很多种，例如可以为gst标签、his标签或mbp标签等。对于给定的纯化标签，利用其来纯化包含该纯化标签的蛋白的技术是本领域技术人员已知的，包括但不限于本申请实施例中使用的gst柱纯化技术。当一个蛋白含有生物素化标签时，基于该标签的生物素化技术也是公知的。本申请所述的“链霉亲和素树脂”是指偶联有链霉亲和素的树脂，本领域中已有可购得的商业化产品。基于上文所述的生物素-链霉亲和素体系能够将生物素化的蛋白连接于链霉亲和素。在一些实施方案中，步骤(2)包括在纯化后从所述融合蛋白切除所述纯化标签。本领域技术人员能够理解，如果所用的纯化标签不会影响gp96-scfv与gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体的结合能力(例如，尺寸较小)，则不需要将其切除。本申请还提供了用于重组表达含有纯化标签、gp96-scfv和生物素化标签的融合蛋白的宿主细胞。本申请所提供的示例性细胞于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmcc12557，分类命名为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)。第五方面，本发明提供了纯化gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体的方法，包括将包含gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体的样品与第一方面所述的亲和树脂接触。本文所用的术语“接触”包括在保证gp96-scfv与gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体中的gp96蛋白表位发生充分特异性结合的条件下，使样品和亲和树脂进行结合。在一些实施方案中，将样品与所述亲和树脂接触之后，利用预洗脱缓冲液洗脱未结合的杂质蛋白(非目的蛋白)。在一些实施方案中，该方法还包括利用洗脱缓冲液洗脱gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体。在一些实施方案中，样品来源于哺乳动物组织或细胞。在一些实施方案中，样品来源于个体的肿瘤组织、非肿瘤病理组织、血液样本中的细胞或体外培养的被病原体感染的哺乳动物细胞或人细胞。在一些实施方案中，样品来源于被细菌感染的哺乳动物细胞或人细胞。在一些实施方案中，样品来源于被流感病毒感染的哺乳动物细胞或人细胞。在一些实施方案中，样品来源于被hiv病毒感染的哺乳动物细胞或人细胞。在一些实施方案中，样品来源于被乙肝病毒感染的哺乳动物细胞或人细胞。第六方面，本发明提供了利用第五方面所述的方法获得的gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体。gp96蛋白-多肽复合体能够激发机体对热休克蛋白结合的抗原多肽的免疫识别和攻击，而且gp96蛋白-多肽复合体携带的抗原包括面广，生物有效性高，能够更好地引起机体产生体液免疫和细胞免疫。因此，在一些实施方案中，利用第六方面所述的方法获得的gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体可用于自身细胞变异、外源性病原体感染以及自身免疫疾病的治疗和预防。在一些实施方案中，所述gp96蛋白和/或gp96蛋白-多肽复合体可用于治疗和/或预防小黑色素瘤。应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。实施例提供以下实施例仅仅是对本申请的一些实施方案进行举例说明，没有任何限制的目的或性质。实施例1：含gst标签、gp96-scfv和生物素化标签的融合蛋白的克隆载体的构建载体酶切按照厂商说明，将带有氨苄青霉素选择性标记和gst标签的细菌质粒载体pgex-6p-1(购自北京拜尔迪生物技术有限公司，型号csb-m13364)按如下体系进行双酶切：xhoi1μl，bamhi1μl，10×缓冲液5μl，载体+水43μl，其中bamhi和xhoi购自thermoscientific。将该酶切混合物在37℃酶切过夜。并通过电泳回收酶切后的载体。gp96-scfv序列扩增按下述pcr体系扩增seqidno:4所示的gp96-scfv+生物素化标签融合分子的核酸编码序列：模板2μl(模板为人工合成)，gp-r(5μmol/l)4μl，gp-f(5μmol/l)4μl，2×pcr扩增预混液25μl，ddh2o15μl，共50μl。引物信息如下：gp96-f：ctgttccaggggcccctgggatcccaggtgcagctggtgc(seqidno:2)gp96-r：agtcagtcacgatgcggccgctcgaggtgccattcg(seqidno:3)pcr扩增的条件为：95℃预变性5min，98℃预变性15s，98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，进行35个循环的扩增反应，然后72℃延伸90s。将获得的pcr产物电泳回收。载体连接随后将回收的载体与回收的pcr产物按下述体系进行连接：gp96-scfvpcr产物3μl，pgex-6p-1载体3μl，10×缓冲液2μl，t4连接酶1μl，h2o11μl，共20μl。将上述连接混合物在37℃连接90min。吸取20μl连接产物于含有100μl大肠杆菌bl21感受态细胞(购自solarbio，型号c1400)的离心管中，轻轻混合均匀，在冰上放置30min。将离心管置于42℃水浴中，热激90s，取出后迅速放于冰上，冷却3min。向离心管中添加900mllb液体培养基，37℃振荡培养60min。将培养物用三角涂布器涂布在选择性lb培养皿(含氨苄青霉素)上，晾干。倒置培养皿，于37℃培养过夜。待单菌落长出后，挑取单菌落。通过菌落pcr验证目的片段大小以筛选阳性菌落。之后挑取筛选得到的阳性菌落的菌体，加入含有氨苄青霉素的lb液体培养基中，在37℃条件下，220rpm振荡过夜培养，提取质粒并进行测序，从而得到正确的阳性克隆。得到的阳性克隆于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc12557。实施例2：gp96-scfv蛋白的诱导表达纯化及gst标签的切除将实施例1得到的正确阳性克隆接种到含终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的lb培养基中活化，得到活化菌株。取活化菌液接入lb培养基中，37℃培养至od600为0.5左右。然后加入iptg(终浓度为0.05mmol/l)，同时加入3％的乙醇，16℃诱导过夜。离心收集菌体。将菌体用表1所示的裂解液重悬，冰浴条件下超声破碎(功率500w，破碎5s停5s，共120次)。将破碎后的菌体4℃20000g/min离心20min，收集上清，并用0.45μm滤膜过滤除菌作为样品。表1裂解液配方：试剂100ml用量终浓度1mtris·hcl，ph7.510ml100mmnacl0.8766g150mm甘油10ml10％(v/v)利用gst柱亲和层析法纯化收集的上清，步骤如下：用10×柱床体积的去离子水清洗封存的层析柱，然后用10×柱床体积的裂解液平衡柱子。用20～30ml蒸馏水清洗蠕动泵，随后以0.3mg/ml流速将收集的上清上柱过夜。用50ml裂解液对层析柱上的一些非特异性结合的杂蛋白进行洗脱。置换表2所示的酶切缓冲液，四维旋转混合仪过夜酶切并收集酶切上清。然后用5ml表3所示的洗脱液洗脱gst标签和ppe(裂前蛋白酶(prescissionprotease))。随后用10×裂解液清洗柱子，平衡，并将柱子保存于裂解液中，4℃存放。将收集的纯化的蛋白用10kd的超滤管进行超滤浓缩。表2酶切缓冲液配方：试剂终浓度1mtris·hcl，ph7.050mmnacl150mmedta1mmdtt1mm表3洗脱缓冲液配方：实施例3：gp96-scfv蛋白的活性鉴定western印迹验证gp96抗原与gp96-scfv抗体蛋白的结合，gp96为发明人纯化得到(按照文献“三步法提取纯化肺腺癌组织中hspgp96多肽复合物”的方法获得)。1.电转移：将未经染色的sds-page凝胶切除多余胶边，放在转移缓冲液中。将剪好的滤纸、nc膜、海绵在电转缓冲液中浸泡。遵循“黑胶白膜”的原则。接通电源，200ma恒流转移2h，转移结束后，取出塑料支架，膜正面朝上放置在适当的容器中。2.封闭：将转移完毕的nc膜在tbst缓冲液中漂洗一次，用10ml封闭液(5％脱脂牛奶)37℃封闭1h。3.一抗反应：封闭完成后，换新的封闭液，加入一抗(生物素化的gp96-scfv抗体)；阳性对照：gp96一抗，购自rdsystems公司，货号：mab7606；阴性对照：鼠源的gst一抗，购自金斯瑞生物科技有限公司，货号：a00867-40。4℃孵育过夜，用tbst洗膜3次，每次10min。4.二抗反应：加入用封闭液稀释的hrp标记的链霉亲合素二抗，对照组加入带有hrp标记的羊抗鼠二抗，反应1h，用tbst洗膜3次，每次10min，其中链霉亲合素购自mabtech,货号为：mab2966；羊抗鼠二抗购自sinobiological公司，货号为：ssa007。5.dab显色：避光条件下，将nc膜置于平皿中，dab显色，用蒸馏水冲洗终止反应，其中dab显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号为：zli-9018。结果显示于图1中。图1a表明，本申请获得的生物素化的gp96-scfv抗体蛋白能够特异性结合gp96抗原；图1b表明，商购的gp96抗体能够特异性结合制备的gp96抗原，而作为阴性对照的无关抗体(鼠源gst一抗)不结合制备的gp96抗原，进一步证明本申请获得的生物素化的gp96-scfv与gp96蛋白结合的特异性。实施例4：蛋白浓度的测定利用下述方法测定本申请获得的蛋白的浓度：完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml；按照50体积的bca试剂a加1体积的bca试剂b配制2.5mlbca工作液，充分混匀；将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品中，加标准稀释液补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml；分别向各孔加入200μlbca工作液，37℃放置30min；用酶标仪测定562nm处的吸光值，得到下表4所示的数据。其中bca试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，货号为p0011。表4：蛋白标准曲线浓度测定样品取10μl，补足到20μl，测定的a562为0.957。利用测定的数据绘制标准品浓度与吸光度的标准曲线，并得到下述浓度计算公式y＝1.2126×x+0.10249，其中r2＝0.99609。根据该公式计算得到蛋白浓度为1.91mg/ml，其中蛋白共计1ml。实施例5：gp96蛋白亲和树脂的制备采用表5中所示的生物素化反应体系将纯化后的gp96-scfv蛋白生物素化，其中生物素连接酶购自genecopoeia，货号为b0101a：表5生物素化反应体系反应物组成体积终浓度10×生物素连接酶缓冲液a25μl1×10×生物素连接酶缓冲液b25μl1×生物素连接酶15μl45u/μl蛋白底物(10nmol)185μl400μm将上述反应体系的混合物于室温孵育5h，以使底物生物素化。按照链霉亲和素树脂(购自上海翊圣生物技术有限公司，货号为s04016)的说明书配制结合缓冲液。平衡链霉亲和素树脂，然后向其中加入已生物素化的gp96-scfv蛋白，将得到的混合物于4℃在四维旋转仪充分反应过夜。取出部分树脂和结合后的上清进行sds-page蛋白凝胶电泳，对gp96-scfv蛋白的生物素化结果进行检测。结果如图2所示。图2中泳道1为标准品蛋白，泳道2为与链霉亲合树脂结合的生物素化的gp96-scfv抗体蛋白，泳道3为结合后的上清中游离的生物素化的gp96-scfv蛋白。图2的泳道2的条带表明生物素化的gp96-scfv抗体蛋白结合于链霉亲合树脂。实施例6：gp96蛋白的纯化于4℃在低盐状态下，将制备的gp96蛋白亲和树脂与含有gp96的肿瘤组织研磨匀浆液结合。采用ph为7.4的含有20mmnah2po4的tris-hcl预洗脱缓冲液洗脱杂蛋白。然后采用含有3.5m氯化镁和20mm磷酸盐的缓冲液洗脱树脂，并收集洗脱液。将收集的洗脱液进行sds-page蛋白凝胶电泳，以检测纯化的gp96蛋白。结果如图3所示。图3中泳道1为收集的gp96；泳道2为标准蛋白质。在不偏离本申请公开的实质和范围的情况下，可对本申请公开的各实施方案进行多种改变和用等同替换。除非上下文中另有说明，否则本公开的实施方案的任何特征、步骤或实施方案都可以与任何其他特征、步骤或实施方案组合使用。当前第1页12