复合微生物发酵制备海藻颗粒钾肥的方法与流程

本发明属于农业肥料领域，具体涉及一种复合微生物发酵制备海藻颗粒钾肥的方法。

背景技术：

化肥的过度施用造成了土壤结构破坏、自然界生物多样性和生态系统稳定性降低、江河湖泊的富营养化、农产品质量下降等一系列较为严重的问题。目前市场上的钾肥品种多是化学填料的复合，缺少功能性增效成分，以此原料制备的复合肥和掺混肥并不能为土壤环境改善和农业的可持续发展带来任何的裨益，反而会形成恶性循环。发展现代农业，实现农业可持续发展，对肥料行业的发展必将提出了新的更高的要求，这就要求传统的成分单一的化学肥料向功能性增效肥料升级。实验证明，增加土壤中有益微生物的含量可以起到平衡土壤酸碱度、调节土壤菌群结构、增强作物的抗病虫害的能力肥料、降解土壤重金属、改量土壤的作用。海藻中含有活性成分可以促进植物体内内源激素的分泌，刺激植物非特异性活性因子的产生，还含有非含氮有机物、钾、钙、镁、锌、碘等十余种矿物质元素和丰富的维生素，可以有效促进植物的生长，提质增产。

我国该品种肥料的研究开发模式仍较为传统，设备工艺不足，依然没有成为功能性增效肥料的创新主体，还存在一些问题和不足：1)菌种与化肥复配工艺不成熟，破坏菌体，导致加入菌量多，存活率低；2)传统的微生物肥料采用大量有机质为填料，导致在存放过程中杂菌大量繁殖，杂菌率较高，微生物腐熟不彻底会导致烧苗烂根；3)微生物在肥料存放过程中菌量下降迅速，保质期短，有效活菌数低；4)所用菌种生命力不强，难以与土壤中原有的微生物抗争而逐渐死亡失效；5)对海藻的处理工艺不成熟造成活性物质的破坏和流失。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，提供一种复合微生物发酵制备海藻颗粒钾肥的方法。通过多种特效菌种对海藻进行分级生物发酵制备海藻功能菌剂，然后通过温和的反击式造粒工艺将其与化肥原料相结合，最终得到富含海藻提取物、特效复合菌种的海藻增效钾肥颗粒。生产工艺稳定可控，绿色环保，适于规模化生产。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种复合微生物发酵制备海藻颗粒钾肥的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备产品A：将新鲜的海洋藻类植物洗净、除杂，浸泡12-48h后，磨浆，转入发酵罐内，110-150℃灭菌15-30min，冷却至20-35℃得到产品A；

2)制备种子液：将蜡样芽孢杆菌活化与扩培，制备蜡样芽孢杆菌种子液X；将巨大芽孢杆菌活化与扩培，制备巨大芽孢杆菌种子液Y；将解淀粉芽孢杆菌活化与扩培，制备解淀粉芽孢杆菌种子液Z；

3)制备产品B：将种子液X接种到产品A中，种子液X用量为产品A质量的10％-20％，发酵温度为30-37℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5-8，溶氧控制在10-40％，转速为100-250r/min，通气量在500-2000L/min，发酵罐压应维持在0.02-0.08Mpa，发酵时间为8-24h，得到产品B；

4)制备产品C：调整产品B的pH至4.0～5.5，并将发酵罐内温度冷却至0℃～5℃，保存2～5天，然后将温度恢复至20℃～35℃，得到产品C；

5)制备产品D：将种子液Y接种到产品C中，种子液Y用量为产品C质量的10％-20％，发酵温度为30-34℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5-8，溶氧控制在10-40％，转速为100-250r/min，通气量在500-2000L/min，发酵罐压应维持在0.02-0.08Mpa，发酵时间为8-24h，得到产品D；

6)制备产品E：调整产品D的pH至4.0～5.5，并将发酵罐内温度冷却至0℃～5℃，保存2～7天，然后将温度恢复至25℃～35℃，得到产品E；

7)制备产品F：将种子液Z接种到产品E中，种子液Z用量为产品E质量的10％-20％，发酵温度为30-34℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5-8，溶氧控制在10-40％，转速为100-250r/min，通气量在500-2000L/min，发酵罐压应维持在0.02-0.08Mpa，发酵时间为8-24h，得到产品F；

8)制备产品G：调整产品F的pH至4.0～5.5，并将发酵罐内温度冷却至0℃～5℃，保存2～7天，然后将温度恢复至25℃～35℃，得到产品G；将G干燥得到海藻复合功能菌剂；

9)制备海藻颗粒钾肥：向100份的钾肥原料中加入5-10份的海藻复合功能菌剂，并混合均匀，经辊压机辊压成型为片状；采用反击式造粒方式进行造粒，过筛烘干后即得成品；

所述钾肥原料是氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或任意比例的两种以上。

步骤2)中的蜡样芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：豆粕粉20g，酵母膏6g，海藻酸钠1.2g，牛胆盐0.05g，磷酸二氢钾0.04g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.2g，甘露醇9.5g，水1000mL，调节pH6.8-7.0，扩培条件为：33℃培养20h。

步骤2)中的巨大芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：红薯粉22g，海藻酸钠0.03g，玉米浆5g，蛋白胨11g，二氧化锰0.02g，磷酸二氢钾0.02g，硫酸亚铁0.2g，水1000mL，调节pH7.2-7.5，扩培条件为：31℃培养20h。

步骤2)中的解淀粉芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：淀粉20g，豆粕40g，酵母膏6g，磷酸二氢钾2.0g，乙酸钠5.0g,硫酸锰0.5g，硫酸镁0.5g，碳酸钙0.3g，水1000ml，调节pH6.8-7.0，扩培条件为：35℃培养24h。

步骤3)至步骤8)中的酸碱调节剂为柠檬酸，草酸，醋酸，磷酸氢二钾，碳酸钠，醋酸钠中的一种或几种。

步骤1)中的海洋藻类植物为铜藻、海带、褐藻、鼠尾藻和马尾藻中的一种或者任意比例的两种以上。

所述巨大芽孢杆菌是巨大芽孢杆菌YIC～BM1，保藏号为CGMCC No.12156。

本发明具有以下有益技术效果：

1.本发明采用的菌种具有高耐盐性，可以直接与无机盐复配，克服了传统菌剂在高盐环境长期存放过程中大量死亡的弊端，大大延长了肥料的保质期。而这种高盐的环境使得其他杂菌不能生存，极大的降低了杂菌率，保证了肥料的高质量。

2.本发明采用复合菌种发酵，各类菌株发挥协同作用，海藻活性物质提取率高，有益次级代谢产物种类丰富；而且巧妙的应用分级发酵，避免了微生物菌群间的相互竞争拮抗，将各自菌群的作用发挥到最大化，产品肥效优于单一的菌种发酵。

3.本发明采用特殊的反击式造粒技术将微生物菌剂与化学肥料复配，整个过程温和绿色环保，避免了高温和化学试剂对微生物和海藻活性成分的破坏，最大限度的保证了微生物的存活率和海藻活性。

4.本发明的产品富含多种对有益微生物，菌种之间发挥协同作用，提高环境适应能力，能够在土壤中大量繁殖，有效提升土壤中的微生物含量，起到缓冲土壤酸碱度，增强植物抗性，改良土壤环境的作用。

5.本发明在传统钾肥的基础上，引入了海藻提取物、有益复合微生物菌剂等功能性成分，是传统肥料的全新升级产品，环保性能与肥效都得到大幅提升。

附图说明

图1是显微观察YIC～BM1菌株的革兰氏染色及聚集成团现象图。

图2基于16SrDNA序列构建的YIC～BM1菌株系统发育树示意图。

图3是不同温度对YIC～BM1菌株产酶的影响的示意图。

图4是不同pH对YIC～BM1菌株产酶的影响示意图。

具体实施方式

结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1：

1)制备产品A：将新鲜的海带和马尾藻(质量比为1:1)洗净、除杂，浸泡20h后，磨浆，转入发酵罐内，110℃灭菌30min，冷却至20℃得到产品A；

2)制备种子液：将蜡样芽孢杆菌活化与扩培，制备蜡样芽孢杆菌种子液X；将巨大芽孢杆菌活化与扩培，制备巨大芽孢杆菌种子液Y；将解淀粉芽孢杆菌活化与扩培，制备解淀粉芽孢杆菌种子液Z；

所述的蜡样芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：豆粕粉20g，酵母膏6g，海藻酸钠1.2g，牛胆盐0.05g，磷酸二氢钾0.04g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.2g，甘露醇9.5g，水1000mL，调节pH6.8-7.0，扩培条件为：33℃培养20h。

所述的巨大芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：红薯粉22g，海藻酸钠0.03g，玉米浆5g，蛋白胨11g，二氧化锰0.02g，磷酸二氢钾0.02g，硫酸亚铁0.2g，水1000mL，调节pH7.2-7.5，扩培条件为：31℃培养20h。

所述的解淀粉芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：淀粉20g，豆粕40g，酵母膏6g，磷酸二氢钾2.0g，乙酸钠5.0g,硫酸锰0.5g，硫酸镁0.5g，碳酸钙0.3g，水1000ml，调节pH6.8-7.0，扩培条件为：35℃培养24h。

3)制备产品B：将种子液X接种到产品A中，种子液X用量为产品A质量的10％，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.8，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.04Mpa，发酵时间为22h，得到产品B；

4)制备产品C：调整产品B的pH至4.5，并将发酵罐内温度冷却至4℃，保存3天，然后将温度恢复至20℃，得到产品C；

5)制备产品D：将种子液Y接种到产品C中，种子液Y用量为产品C质量的12％，发酵温度为34℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.0，溶氧控制在30％，转速为180r/min，通气量在750L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为18h，得到产品D；

6)制备产品E：调整产品D的pH至4.5，并将发酵罐内温度冷却至3℃，保存2天，然后将温度恢复至25℃，得到产品E；

7)制备产品F：将种子液Z接种到产品E中，种子液Z用量为产品E质量的10％，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在25％，转速为200r/min，通气量在900L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为18h，得到产品F；

8)制备产品G：调整产品F的pH至5.0，并将发酵罐内温度冷却至5℃，保存2天，然后将温度恢复至35℃，得到产品G；将G干燥得到海藻复合功能菌剂。

9)制备海藻颗粒钾肥：向100份的硫酸钾中加入8份的海藻复合功能菌剂，并混合均匀，经辊压机辊压成型为片状；采用反击式造粒方式进行造粒，过筛烘干后即得成品。

实施例2：

1)制备产品A：将新鲜的铜藻洗净、除杂，浸泡24h后，磨浆，转入发酵罐内，120℃灭菌15min，冷却至20℃得到产品A；

2)制备种子液：操作方法与实施例1相同。

3)制备产品B：将种子液X接种到产品A中，种子液X用量为产品A质量的12％，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.6，溶氧控制在25％，转速为180r/min，通气量在850L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为21h，得到产品B；

4)制备产品C：调整产品B的pH至4.5，并将发酵罐内温度冷却至4℃，保存1天，然后将温度恢复至25℃，得到产品C；

5)制备产品D：将种子液Y接种到产品C中，种子液Y用量为产品C质量的10％，发酵温度为34℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.0，溶氧控制在30％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.04Mpa，发酵时间为20h，得到产品D；

6)制备产品E：调整产品D的pH至5.0，并将发酵罐内温度冷却至5℃，保存3天，然后将温度恢复至25℃，得到产品E；

7)制备产品F：将种子液Z接种到产品E中，种子液Z用量为产品E质量的15％，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.8，溶氧控制在30％，转速为200r/min，通气量在750L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品F；

8)制备产品G：调整产品F的pH至4.5，并将发酵罐内温度冷却至5℃，保存2天，然后将温度恢复至25℃，得到产品G；将G干燥得到海藻复合功能菌剂。

9)制备海藻颗粒钾肥：向100份的氯化钾和硫酸钾(质量比为1:1)的混合物中加入8份的海藻复合功能菌剂，并混合均匀，经辊压机辊压成型为片状；采用反击式造粒方式进行造粒，过筛烘干后即得成品。

对比例1：

只采用单一菌种发酵。

1)制备产品A：将新鲜的鼠尾藻洗净、除杂，浸泡30h后，磨浆，转入发酵罐内，120℃灭菌20min，冷却至30℃得到产品A；

2)制备种子液：将蜡样芽孢杆菌活化与扩培，制备蜡样芽孢杆菌种子液X；

所述的蜡样芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：豆粕粉20g，酵母膏6g，海藻酸钠1.2g，牛胆盐0.05g，磷酸二氢钾0.04g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.2g，甘露醇9.5g，水1000mL，调节pH6.8-7.0，扩培条件为：33℃培养20h。

3)制备产品B：将种子液X接种到产品A中，种子液X用量为产品A质量的10％，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.8，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.04Mpa，发酵时间为22h，得到产品B；

4)制备产品C：调整产品B的pH至4.5，并将发酵罐内温度冷却至4℃，保存3天，然后将温度恢复至20℃，得到产品C；将C干燥得到海藻复合功能菌剂。

5)制备海藻颗粒钾肥：向100份的硫酸钾中加入8份的海藻复合功能菌剂，并混合均匀，经辊压机辊压成型为片状；采用反击式造粒方式进行造粒，过筛烘干后即得成品。

对比例2：

海藻不经过发酵直接与钾肥复配

1)制备产品A：将新鲜的海带和马尾藻(质量比为1:1)洗净、除杂，浸泡20h后，磨浆，转入发酵罐内，110℃浸提30min，冷却至20℃得到产品A,将A干燥制备海藻浸粉B；

2)制备海藻颗粒钾肥：向100份的氯化钾和硫酸钾(质量比为1:1)的混合物中加入8份的海藻浸粉B，并混合均匀，经辊压机辊压成型为片状；采用反击式造粒方式进行造粒，过筛烘干后即得成品。

产品指标检测结果见表1。

表1：产品检测结果

其中传统钾肥采用的是农业级硫酸钾。

结果表明：区别于传统的钾肥，本发明制备的产品中不仅含有高含量的有效活菌，而且丰富的海藻提取物，包括海藻酸和褐藻寡糖；复合分级发酵的活菌数以及海藻提取物的含量高于单一菌种的发酵；海藻经过发酵后海藻活性物质的含量大幅提高。

将本发明的实施例和对比例相关肥料施于玉米种植地块，亩用量为50kg。种植期为半年，常规除草、除虫、合理灌溉、保证充足水分，在N、P同一水平上进行比较。以传统钾肥作为对照组，结果如表2所示。

表2：玉米施肥对比实验结果

实验表明，使用实施1样品的玉米，提高了农作物产量，相比传统钾肥实现了12％的增收，而且降低了作物的病虫害。明显提高了土壤中微生物的含量，有效调节土壤的pH值，降低了土壤容重，有效改良了土壤性能。

实施例和对比例的数据表明，海藻经过发酵处理后的增产抗病效果大幅度提升，利于实现海藻价值的最大化；而复合分级发酵肥效优于单一菌种发酵。

所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCC No.12156；保藏单位名称是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2016年3月2日；拉丁文分类命名为：Bacillus megaterium。

所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的生物特性如下：

纤维素培养基：羟甲基纤维素钠15g，硝酸铵1g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾2g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。

液体发酵培养基：羟甲基纤维素钠10g，蛋白胨3g，酵母粉0.5g，硝酸铵2g，硫酸镁0.3g，磷酸二氢钾2g，氯化钙0.3g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.4。

YIC～BM1菌株在纤维素培养基平板上生长48h后，菌落圆形，白色，表面平整。显微镜观察菌株为革兰氏阳性，杆状，能运动，产芽孢。生长温度范围20～40℃，PH范围6-10，NaCl浓度范围0～20％，菌株最适生长温度37℃，最适生长pH 7.5。触酶，氧化酶，半乳糖苷酶阳性，吲哚，VP实验阴性，不还原硝酸；能够利用葡萄糖，甘露糖，乳糖，棉子糖，蔗糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇，山梨醇。根据其生理生化特征，将该菌株鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。

图1看出，YIC～BM1菌株为革兰氏阳性菌；

图2看出，YIC～BM1菌株的亲缘关系与巨大芽孢杆菌最近；

图3看出，YIC～BM1菌株的最适产酶温度为35℃；

图4看出，YIC～BM1菌株的最佳产酶pH为6.0。

本发明所述的反击式造粒方式是指采用公开号为“CN 102775255”的中国专利“复混肥反击造粒机及使用该反击造粒机的复混肥生产线”所公布的造粒设备进行造粒。