一种去除总RNA样品中核糖体核酸rRNA的方法和组合物与流程

本发明涉及用于一种去除总RNA样品中核糖体核酸rRNA的方法、组合物和试剂盒。

背景技术：

由于rRNA丰度含量非常高，占总RNA量的80％～95％，它的存在会使得样本中其他相关RNA分子的各类分析复杂化。由rRNA所引起的诸多问题是对片段化的相关RNA分子进行分析的难题。例如转录组芯片分析和转录组测序，都会产生很大一部分冗余数据，造成很大的浪费。如果能高效去除rRNA能极大提高数据的有效利用率。特别是在非3’Poly A尾RNA和非编码RNA的分析上，必须去除rRNA，否则这些基因的数据可利用率十分差。

目前，在样品总RNA中去除rRNA技术原理基本都是基于带有链亲霉素基团的磁珠结合rRNA-DNA探针(生物素基团标记)复合物，用于从相关的非rRNA的RNA分子去除rRNA(如Ingolia等人的方法，Science324：218-23，2009)的效果。现有的商品试剂盒，如Ribo-Zero gold(Epicentre)，Ribo-Minus^TM(Thermo Fisher Scientific)，它们虽然都能去除大部分rRNA，但是基于磁珠的去除方法成本比较高，而且去除效果也不理想，特别对于小rRNA，如5S和5.8S rRNA，去除效率都不高于80％，这些残留的rRNA往往在分析中也会占据大量数据容量，造成极大浪费。其次上述方法对于样品总RNA质量要求高，若样品总RNA有轻微降解，rRNA去除效果会受极大影响。因此，需要对现有去除rRNA技术进行改进，以实现高效且费用低的去除rRNA。

技术实现要素：

可以理解，本文所用术语的目的仅仅在于描述具体的实施方式，而非进行限制。进一步的，除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的相同的含义。将根据下文阐述的定义，使用如下术语和语法变体以描述和要求保护本发明。

本发明涉及一种去除总RNA样品中核糖体核酸rRNA的方法，所述方法包含:

a)提供包含衍生自至少一种真核生物体或者物种的RNA分子的初始样本，其中所述RNA分子包含rRNA分子和非rRNA的RNA分子；

b)针对真核生物体或者物种的rRNA的全长序列每50bp设计一个与rRNA序列反向互补配对的DNA探针；

c)在一定条件下使所述初始样本接触所述包含所述DNA探针的组合物，以便至少部分所述DNA探针和rRNA分子杂交形成DNA:RNA杂交双链，从而生成处理后的样本；

d)在一定条件下使所述处理后的样本接触RNase H酶，特异性消化所述DNA：RNA杂交双链，从而生成rRNA除尽的样本，其中所述rRNA除尽的样本包含存在于所述初始样本中的所述非rRNA的RNA分子的至少部分并大体上除尽或者不含rRNA分子；

e)在一定条件下使所述rRNA除尽的样本接触DNase混合酶去除样品中痕量DNA和/或降解剩余DNA探针混合物，终止反应；

f)纯化，获得样品RNA。

在本发明的一个实施例中，至少一种真核生物体或者物种选自人类、动物、植物以及真菌生物体或者物种。

优选的，所述rRNA除尽了样本中的99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的rRNA分子。

在本发明的一个实施例中，所述rRNA分子包括5S rRNA，5.8S rRNA，18S rRNA，28S rRNA，25SrRNA分子，26SrRNA，23S rRNA，12S rRNA 和16S rRNA组成的组中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，初始样本中的所述RNA分子包含提取、分离或者纯化自选自如下的来源的RNA：组织样本、细胞样本、石蜡包埋的样本、石蜡包埋福尔马林固定的样本和由土壤、水、生长培养基或者生物流体或者标本组成的环境样本。

优选的，步骤b)中DNA探针长度范围为：30bp至100bp，优选长度为48bp、49bp或50bp。

更优选的，步骤c)所述DNA探针和rRNA分子杂交形成DNA:RNA杂交双链的方法为，将初始样本与DNA探针混合，加入Tris-Hcl和KCl组成的pH7.5的反应试剂和无RNA酶灭菌水，将上述混合溶液在PCR仪器上进行杂交反应；优选的，初始样本中总RNA与DNA探针的用量比例为1:1至1:10。

在本发明的一个实施例中，步骤e)中DNase混合酶为DNaseI和Exonuclease I以等比例混合而成。

同时，本发明还涉及一种DNA探针组合物：针对真核生物体或者物种的5S rRNA，5.8S rRNA，18S rRNA，28S rRNA，25SrRNA分子，26SrRNA，23S rRNA，12S rRNA和16S rRNA组成的组中的一种或多种的全长序列每50bp设计一个与rRNA序列反向互补配对的DNA探针，DNA探针长度范围为30bp至100bp，优选长度为48bp、49bp或50bp。

本发明还涉及一种包括DNA探针组合物的试剂盒。

当术语“例如”、“如”、“包括”、“包含”或者其变体用于本文时，这些术语将不被视为限制性术语，而将被诠释为“但不仅限于”或者“无限制性”。

在某些实施方式中，所述DNA探针与显示rRNA分子的序列的至少95％，96％，97％，98％，99.0％，99.3％，99.5％，99.9％或者100％进行特异性杂交。

如本文所用，短语“rRNA除尽的样本”通过去除某些量的rRNA分子同时保留至少90％的所述非rRNA的RNA分子进行样本纯化。在某些实施方式中，至少91％，93％，96％，97％，98％，98.5％，99.0％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％99.9％或者100％的所述量的非rRNA的RNA分子存在于所述rRNA除尽的样本中。

如本文所用，术语“rRNA除尽”指纯化的样本，其中存在于所述初始样本中的显示了来自所述至少一种rRNA分子的核酸序列的所有分子的5％或者更少仍然存在于所述rRNA除尽的样本中。在某些实施方式中，存在于所述初始样本中的显示了来自特定的rRNA分子的核酸序列的所有分子的5％，4％，3％，2％，1.5％，1.0％，0.5％，0.1％，0.09％，0.08％，0.07％，0.06％，0.05％，0.04％，0.03％，0.02％或者0.01％或者更少。

具有本领域知识的人员会知道或者容易地发现用于检定存在于所述初始样本和所述rRNA除尽的样本中的所述量的显示所述至少一种rRNA分子的序列的RNA分子的方法。例如，在一个实施方式中，显示所述至少一种rRNA分子的序列的RNA分子的百分比基于所述初始样本和所述rRNA除尽的样本中的所述量的显示所述至少一种rRNA分子的序列的RNA分子，如利用逆转录实时PCR(RT-qPCR)予以测定。

如本文所用，术语“rRNA除尽的样本”或者“大体上不含rRNA分子的样本”在本文中有时指“rRNA削减的样本”或者“削减的样本”以及所述“用于生成rRNA除尽的样本的方法”或者所述“用于从样本分离rRNA的方法”在本文中有时指“用于rRNA削减的方法”或者，更简单地，指“rRNA削减”。本文的术语“rRNA削减”将意指“用于生成rRNA除尽的样本的方法或者用于从样本中分离rRNA的方法”。类似地，当动词形式“削减”用于本文时，它将意指“一种执行用于生成rRNA除尽样本或者用于从样本分离rRNA的方法的方法或工艺”以及本文中的术语“削减的”将意指“经过执行所述方法或工艺所述样本的rRNA除尽的状态”。

如本文所用，术语“杂交”用以指互补核酸的配对。杂交以及杂交强度(即核酸之间的关联强度)受许多因素影响，例如核酸之间的互补程度、所涉及条件的严谨度、所形成的杂交体的解链温度(Tm)以及核酸内的G∶C比率。其结构内包含互补核酸配对的单分子被称为“自交”的分子。核杂交的丰富指导资料可见于Tijssen，Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，″Elsevier(1993)，其以引用方式并入本文。

可以使用柱式纯化技术进行纯化，可使用RNA Clean&Concentrator TM-5柱(Zymo Research；CatalogNumbersRl015，Rl016)，以纯化所述rRNA除尽RNA样本。如果使用所述RNA Clean&Concentrator TM-5柱，请遵循制造商的步骤”。

同时可以选择纯化方法，乙醇沉淀纯化方法， XP(Beckman Coulter)对RNA进行抽提纯化。

洗脱的RNA可选择立即使用或者于-70℃至-80℃下储存。

术语“测序技术”据本发明生成的纯化的RNA样本可以利用任何类型的适当的测序技术进行测序。所采用的类型的测序方法不对本发明形成限制。下文对示例性的测序方法进行描述。

核酸测序技术的描述性的非限制性的例子包括但不仅限于链终止子(Sanger)测序以及染料终止子测序。在焦磷酸测序(Voelkerding等人，ClinicalChem.，55：641-658，2009；MacLean等人，NatureRev.Microbiol.，7：287-296；美国专利号6210891；美国专利号6258568；每个以引用方式整体并入本文)中，通过用泳道有与接头互补的寡核苷酸的微球捕获单个模板分子将模板DNA分成片段、进行末端修复、连接至所述接头并以克隆方式进行原位扩增。

在Solexa/Illumina平台(Voelkerding等人，ClinicalChem.，55：641-658，2009；MacLean等人，NatureRev.Microbiol.，7：287-296；美国专利号6833246；美国专利号7115400；美国专利号6969488；每个以引用方式整体并入本文)中，测序数据以长度较短的读段的形式产生。

利用SOLiD技术对核酸分子的测序(Voelkerding等人，Clinical Chem.，55：641-658，2009；MacLean等人，Nature Rev.Microbiol.，7：287-296；美国专利号5912148；美国专利号6130073；每个以引用方式整体并入本文)还涉及模板的片段化、连接至寡核苷酸接头、附至微球以及通过乳化PCR的克隆扩增。

Helicos Bio Sciences的HeliScope(Voelkerding等人，Clinical Chem.，55：641-658，2009；MacLean等人，Nature Rev.Microbiol.，7：287-296；美国专利号7169560；美国专利号7282337；美国专利号7482120；美国专利号7501245；美国专利号6818395；美国专利号6911345；美国专利号7501245；每个以引用方式整体并入本文)是第一个商业化的单分子测序平台。

除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术，这落入本领域技术范围内。这样的技术在文献中有充分的说明，例如：《分子克隆实验指南》，第2版，Sambrook等人，1989；Oligonucleotide Synthesis，MJ Gait编辑，1984；Animal Cell Culture，R.I.Freshney编辑，1987；Methods in Enzymology，Academic Press，Inc.；Handbook of Experimental Immunology，第4版，D.M.Weir&CC.Blackwell编辑，Blackwell Science Inc.，1987；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells，J.M.Miller&M.P.Calos编辑，1987；Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编辑，1987；以及PCR：The Polymerase Chain Reaction，Mullis等人编辑，1994。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1 一种基于杂交降解法的在样品总RNA中高效去除核糖体rRNA的方法原理。

图2 总RNA与本发明的杂交降解法处理后的RNA检测结果；图中，Total RNA为输入的人A549细胞系总RNA；N为不加入DNA探针，加入RNase H和DNase混合酶正常进行反应。

图3：人A549总RNA与本发明的杂交降解法处理后的RNA中rRNA的RT-PCR检测结果；N为去除前，R为去除后。

图4：人A549总RNA与本发明的杂交降解法处理后的RNA中高丰度mRNA的RT-PCR检测结果；N为未去除rRNA。(A)为检测5.8S rRNA的结果，可见本发明方法已完全去除rRNA，而相比之下RiboZero还有相当一部分rRNA未能去除干净；(B)为检测GAPDH基因的mRNA的量的结果，与未进行rRNA去除的样本相比，本发明方法不影响mRNA的量，而RiboZero的两次重复实验不同程度地损失了mRNA。

图5：人A549细胞总RNA与本发明的杂交降解法处理后的RNA中低丰度mRNA的RT-PCR检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司购得：

RNase H酶(#EN0202，Thermo Scientific，美国)；

RNase H反应试剂(#EN0202，Thermo Scientific，美国)；

DNase混合酶(DNAse I:Thermo Scientific，#EN0521；Exonuclease I:Thermo Scientific，#EN0581，美国)；

DNase I反应试剂(Thermo Scientific，#EN0521，美国)；

Reagent(美国)；

XP(Beckman Coulter，德国)；

Glycogen(Thermo Scientific^TM，#R0551，美国)；

Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit(H/M/R)(Illumina#MRZG12324，美国)。

实施例1：基于杂交降解法的在样品总RNA中高效去除核糖体rRNA的方法原理

本发明提供去除核糖体rRNA的具体方法，包括以下步骤，如图1所示。

1.针对样品不同物种，对该物种的所有rRNA的全长序列设计探针，将探针混合。

2.在样品总RNA中加入探针混合物，缓慢退火，探针与目标rRNA特异性杂交结合，形成DNA:RNA杂交双链；

3.加入RNase H酶特异性降解探针与rRNA结合的杂交双链；

4.DNase混合酶去除样品中痕量DNA和降解剩余DNA探针混合物，并终止反应；

5.纯化去除rRNA后的样品RNA。

该方法可以广泛用于多种物种样品中总RNA的rRNA高效去除。

实施例2：DNA探针的设计

针对样品不同的物种，本发明方法对不同物种的所有rRNA的全长序列。

本实施例中设计去除人类rRNA(包含28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、12S rRNA、16S rRNA)的DNA探针。具体方法如下：

从NCBI上获取人类rRNA全长序列，5S rRNA(登录号：NR_023379)、5.8S rRNA(登录号：NR_003285)、12S rRNA(登录号：NC_012920.1(648-1601))、16S rRNA(登录号：NC_012920.1(1671-3229))、18S rRNA(登录号：NR_003286)、28S rRNA(登录号：NR_003287)。

人源RNA中5S rRNA(121bp)、5.8S rRNA(159bp)、12S rRNA(954bp)、16S rRNA(1559bp)、18S rRNA(1969bp)、28S rRNA(5025bp)，这些rRNA全长序列总共长9787bp，针对这些rRNA的全长序列，每隔5bp设计一个50bp与rRNA序列反向互补配对的单链DNA探针，一共设计185个探针。

实施例3：获得DNA探针序列

设计并制备单链DNA探针，具体序列如下：

所有探针分子等比例混合，组成探针混合物，且探针混合物中每个探针的浓度为5μg。

实施例4：DNA探针添加比例的优化实验

在5μg总RNA中，分别为加入额定量0.1x，0.5x，1x的探针DNA，并依次加入RNase H和DNase混合酶按操作步骤进行rRNA去除。使用2.7％琼脂糖凝胶进行电泳，通过SybrGreen II染色，由图2可以看出，加入1x额定量探针时，可将rRNA完全降解成极小的片段，达成rRNA去除的目的。

实施例5：DNA:RNA杂交双链的制备

样品5μg总RNA，加入5ug探针混合物，加入5μl pH 7.5的反应试剂(200mM Tris-Hcl和50mM KCl)与无RNA酶灭菌水至终体积20μl。样品用移液枪吹打均匀后，在PCR仪器上进行杂交反应。

采用下面20μl的反应体系进行探针与rRNA杂交反应体系如下:

上述反应体系使用移液枪吹吸混匀后，使用PCR仪器，95℃加热2min，然后从95℃每隔1s减低0.1℃，直到温度达到22℃，22℃保持5min。

获得探针与rRNA序列杂交形成DNA:RNA杂交双链。

实施例6：去除杂交结合的rRNA

加入杂交反应体系、RNase H酶、RNase H反应试剂与无RNA酶灭菌水至终体积40μl，具体体系如下：

反应体系使用移液枪吹吸混匀后，使用PCR仪器，设定温度37℃反应45min，反应去除杂交结合的rRNA。

实施例7：去除剩余的痕量DNA和降解剩余DNA探针混合物

去除杂交反应体系加入DNase混合酶、DNase I反应试剂与无RNA酶灭菌水至终体积，反应体系如下：

反应体系使用移液枪吹吸混匀后，使用PCR仪器，设定温度37℃反应45min。

实施例8：纯化去除rRNA后的RNA样品

纯化样品去除rRNA后的总RNA，可选择纯化方法，乙醇沉淀纯化方法， XP(Beckman Coulter)纯化RNA。具体操作方法如下：

加入Ambion TRIZOL 1mL，摇匀，室温放置5min，加入200μl氯仿，摇匀，在离心机4℃低温12000g离心15min，分离上清到新管，加入2μl Glycogen(5mg/ml)然后加入200μl异丙醇。样品-20℃放置过夜或-20℃放置4小时以上。样品在离心机4℃低温12000g离心15min，小心移除上清，加入75％冷乙醇清洗两次后，4℃低温离心8min，移除乙醇后，晾干，加入无RNase灭菌水。

获得的去除rRNA的总RNA样品。

使用2.7％琼脂糖凝胶进行电泳，通过SybrGreen II染色，由图3可以看出，本发明方法可一次性去除核编码的28S，18S，5.8S rRNA以及线粒体编码的12S，16S mt-rRNA。去除rRNA后，所有rRNA已无法用RT-PCR检出。

通过上述方法，去除样品总RNA中99.9％的rRNA。

实施例9：纯化结果验证

使用本发明方法去除人A549细胞5μg总RNA中的rRNA，通过RT-PCR比较去除前后rRNA的量以及mRNA的量。

在相同条件下，设置对照组，对照组使用Illumina Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit(Human/Mouse/Rat)试剂盒进行rRNA去除。

实验组和对照组分别使用2.7％琼脂糖凝胶进行电泳，通过SybrGreen II染色，由图4可以看出，可见本发明方法已完全去除rRNA，而相比之下Ribo-Zero还有相当一部分rRNA未能去除干净。检测实验组和对照组的GAPDH基因的mRNA的量。与未进行rRNA去除的样本相比，本发明方法不影响mRNA的量，而Ribo-Zero的两次重复实验不同程度地损失了mRNA。

实施例10：纯化结果验证

实验组和对照组分别使用2.7％琼脂糖凝胶进行电泳，通过SybrGreen II染色，检测低丰度的EIF3J mRNA的量，由图5可以看出，与未进行rRNA去除的样本相比，本发明方法不影响mRNA的量，而RiboZero在第2次重复实验中损失了大部分的EIF3J mRNA。

所述方法获得的总RNA样品，可以进行后续的实验分析，例如RT-qPCR，转录组建库测序等。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。