本发明涉及一种人类视网膜色素上皮细胞层的分离培养方法，具体涉及人类RPE细胞的分离培养，属于生物医学
技术领域：
。
背景技术：
：RPE细胞层是位于视网膜外部的连续单层细胞，因其铺路石状的形态和胞质内丰富的黑色素而得名。它们在视网膜细胞的维持和自我更新上发挥重要的功能，如：吞噬消化脱落的光感受器细胞的OS；促进视循环中重要的介质11-顺视黄醛的再生；调节眼内的免疫反应；参与形成视网膜-血管屏障等。RPE细胞的这一生理功能异常被认为与相关眼科疾病的发生密切相关，如RPE细胞屏障功能异常则易导致Best卵黄样黄斑营养不良(Bestvitelliformmaculardystrophy，BVMD)和成人卵黄样黄斑营养不良(adult-onsetitelliformmaculardystrophy，AVMD)。RPE基底膜与Bruch’smembrane之间的连接或功能异常被认为与年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，AMD)和Sorsby’s眼底营养不良的发生相关。AMD主要表现为RPE细胞层对视细胞外节盘膜吞噬消化能力下降，结果使未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排除沉积于Bruch膜，形成玻璃膜疣。AMD分为干性和湿性两种，其中，干性AMD更为常见，是由于RPE细胞进行性营养不良造成的脉络膜毛细血管和光受体缺失的一种疾病。湿性AMD的典型特征是由脉络膜新生血管(choroidalneovascularization，CNV)生成，从而造成严重的视力丧失。除了细胞替代治疗，目前尚无逆转这一退行性过程并回复视力的有效办法。RPE细胞治疗AMD的试验显示通过在视网膜下腔移植正常RPE细胞，能够延缓进行性的视觉功能丧失。RPE细胞移植在RPE细胞遗传缺陷动物模型和AMD病人上的试验，都显示能够延缓视网膜的退行性病变，改善视觉功能。RPE细胞在视网膜下腔的自体移植比较稳定，且具有长期的疗效，但是自体RPE细胞来源及适量的有限性限制了该方法在临床上的广泛应用。技术实现要素：本发明的目的在于克服原有分离方法不足之处，提供一种简单易操作的人类RPE细胞的分离培养方法，为体外培养、扩增RPE细胞，治疗AMD等RPE细胞损伤疾病提供了新来源。按照本发明提供的技术方案，一种人类视网膜色素上皮细胞层的分离培养方法，具体步骤为：(1)缓冲液浸泡清洗：将待处理的眼球放入加有青霉素-链霉素的DPBS缓冲液浸泡中浸泡4～6min；将浸泡完毕的眼球用DPBS缓冲液清洗1～3次，每次8～12s；(2)分离：对步骤(1)所得眼球分离角膜和虹膜，去除晶状体和玻璃体，轻轻挤压，使眼杯展开，去除神经层；(3)酶溶液浸泡清洗：将步骤(2)所得视杯转移到1～3mL分离酶溶液(1X)中浸泡，在37℃下消化20～30min；(4)清洗：将步骤(3)所得视杯转移到DPBS缓冲液中，从视杯中揭下RPE细胞层，并将RPE细胞层转移到5～10mL的DPBS缓冲液中，1800～2200rpm离心5～10min；(5)消化：离心结束后吸除上清，加入1～2mL质量浓度为0.25％的TE缓冲液，在37℃下消化5～10min；(6)培养重悬：在步骤(5)所得消化后的RPE细胞中加入4～8mLRPE培养基，1800-2200rpm离心5～10min，吸除上清再用2～4mLRPE培养基重悬，然后接种到cell-start基质胶包被的六孔板的一孔中；培养至第三天换液，然后每隔两天换液一次，直到细胞达到覆盖90％时传代。进一步的，步骤(1)所述加有青霉素-链霉素的DPBS缓冲液配置过程如下：取500mL的DPBS缓冲液，添加10mL的青霉素-链霉素，充分混合。进一步的，步骤(6)所述RPE培养基配方如下：500mL的αMEM培养基，5mL的N1添加剂，5mL的谷氨酰胺，5mL的非必须氨基酸，150mg的牛磺酸，15μg氢化可的松，0.010μg的三碘甲状腺原氨酸，50mL的人血小板裂解液，充分混合。进一步的，氢化可的松和三碘甲状腺原氨酸在配置RPE培养基时首先溶解在DPBS中，并保存在-20℃下。进一步的，步骤(6)所述传代具体为将所得RPE细胞由P0到P1传代，方法为：取6孔板，采用1×DPBS缓冲液清洗，6孔板每孔加1～2mL质量浓度为0.25％的TE缓冲液，培养箱中37℃孵育5～10min，然后加入5～10mLRPE培养基，收集RPE细胞至15mL离心管，细胞计数，1800～2200rpm离心5～10min，吸除上清，加RPE培养基悬浮细胞，6孔板中每孔接种5×105个细胞。进一步的，步骤(1)中所述的眼球为12～18周的人类眼球。本发明的有益效果：本发明提供的对人类RPE细胞层分离培养方法步骤简单易操作；在细胞分离的过程中能最大限度的保存RPE细胞层的完整性；在细胞分离过程中能完整的将RPE细胞层与脉络层分离开，获得的细胞纯度高；后续培养中细胞纯度高、均一性高、增殖能力出色、能更早的分化成具有典型形态的细胞；为体外培养、扩增RPE细胞，治疗AMD等RPE细胞损伤提供了新来源。附图说明图1为实施例1分离酶处理后分离结果示意图。图2为实施例2未经分离酶处理后分离结果示意图。图3为分离酶处理后培养细胞示意图(10d)。图4为未经分离酶处理培养细胞示意图(10d)。具体实施方式为了使本领域的人员更好的了解本发明，并使本发明的上述优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例中的青霉素-链霉素、谷氨酰胺、非必须氨基酸购自LIFETECHOLOGISE公司；DPBS缓冲液购自GIBCO公司；DispaseⅡ购自ROCHE罗氏公司；TE缓冲液购自INVITROGEN公司；cell-start基质胶、αMEM培养基、N1添加剂、牛磺酸、氢化可的松、三碘甲状腺原氨酸购自SIGMA公司；人血小板裂解液购自HELIOS公司。实施例1按照表1中的配方配置RPE培养基。表1组分含量α修饰低限基本培养基(MEM，αmodification)500mlN1添加剂(N1supplement)5ml谷氨酰胺(Glutamine)5ml非必须氨基酸(Nonessentialaminoacids)5ml牛磺酸(Taurine)150mg氢化可的松(Hydrocortisone)15ug三碘甲状腺原氨酸(Triiodo-thyronin)0.010ug人血小板裂解液(HPL)50ml按照以下步骤分离培养人类RPE细胞：(1)缓冲液浸泡清洗：取12周的人类眼球，用加有青霉素-链霉素的DPBS缓冲液清洗眼球1次，6min，用DPBS缓冲液清洗2次，每次12s；所述加有青霉素-链霉素的DPBS缓冲液配置过程如下：取500mL的DPBS缓冲液，添加10mL的青霉素-链霉素，充分混合。(2)分离：在角膜边缘2mm处切一小口，仔细的分离角膜和虹膜，取出晶状体和玻璃体，剥离神经层，轻轻挤压视杯，将视杯平铺；(3)酶溶液浸泡清洗：将视杯放入1mL分离酶溶液中，在37℃下浸泡25min；(4)清洗：将步骤(3)所得视杯从分离酶分离液中取出，转移到1×DPBS缓冲液中，从视杯中揭下RPE细胞层，对所得RPE细胞层进行观察，结果如图1所示；随后将RPE细胞层转移到10mL的DPBS缓冲液中，2200rpm离心10min；(5)消化：离心结束后吸除上清，加入2mL质量浓度为0.25％的TE缓冲液，在37℃下消化10min；(6)培养重悬：用移液器轻轻吹打步骤(5)所得RPE细胞层，将RPE细胞层吹散；在RPE细胞中加入8mLRPE培养基，2200rpm离心10min，吸除上清，再用4mLRPE培养基重悬，然后接种到cell-start(基质胶)包被的六孔板的一个孔中；培养过夜，第三天换液，每周换液两次，直到细胞达到覆盖80％～90％时传代，对其进行观察，具体结果如图3所示，经过分离酶处理的细胞生长快，杂细胞少，纯度高。氢化可的松和三碘甲状腺原氨酸在配置RPE培养基时首先溶解在DPBS中，并保存在-20℃下。步骤(6)所述传代具体为将所得RPE细胞由P0到P1传代，方法为：取出RPE细胞，用1×DPBS缓冲液清洗，6孔板每孔加2mL质量浓度为0.25％的TE缓冲液，培养箱中37℃孵育10min，然后加入10mLRPE培养基，收集RPE细胞至15mL离心管，细胞计数，2200rpm离心10min，吸除上清，加RPE培养基悬浮细胞，6孔板中每孔接种5×105个细胞。实施例2RPE培养基配置同实施例1。具体步骤为：(1)缓冲液浸泡清洗：将18周的人类眼球，放入加有青霉素-链霉素的DPBS缓冲液浸泡中浸泡6min；将浸泡完毕的眼球用DPBS缓冲液清洗1次，每次12s；所述加有青霉素-链霉素的DPBS缓冲液配置过程如下：取500mL的DPBS缓冲液，添加10mL的青霉素-链霉素，充分混合。(2)分离：对步骤(1)所得眼球在角膜边缘2mm处切一小口，仔细的分离角膜和虹膜，去除晶状体和玻璃体，轻轻挤压，使眼杯展开，去除神经层；(3)清洗：从视杯中揭下RPE细胞层，对所得RPE细胞层进行观察，结果如图2所示；将RPE细胞层转移到10mL的DPBS缓冲液中，2200rpm离心10min；(4)消化：离心结束后吸除上清，加入2mL质量浓度为0.25％的TE缓冲液，在37℃下消化10min；(5)培养重悬：用移液器轻轻吹打步骤(4)所得RPE细胞层，将RPE细胞层吹散；在RPE细胞中加入10mLRPE培养基，2200rpm离心10min，吸除上清再用4mLRPE培养基重悬，然后接种到cell-start基质胶包被的六孔板的一孔中；培养至第三天换液，然后每隔两天换液一次，直到细胞达到覆盖90％时传代。氢化可的松和三碘甲状腺原氨酸在配置RPE培养基时首先溶解在DPBS中，并保存在-20℃下。步骤(5)所述传代具体为将所得人类RPE细胞由P0到P1传代，方法为：取出RPE细胞，用1×DPBS缓冲液清洗，6孔板每孔加2mL质量浓度为0.25％的TE缓冲液，培养箱中37℃孵育10min，然后加入10mLRPE培养基，收集RPE细胞至15mL离心管，细胞计数，2200rpm离心10min，吸除上清，加RPE培养基悬浮细胞，6孔板中每孔接种5×105个细胞。对比实施例1取18周的人类眼球进行分离培养人类RPE细胞，除未经过分离酶溶液处理以外，同实施例1，对所得的RPE细胞培养操作同步。经过分离酶溶液处理后RPE细胞分离结果示意图如图1所示，分离后RPE细胞层完整性高，纯度较高，杂细胞较少。未经分离酶溶液处理RPE细胞层分离结果示意图如图2所示，分离后RPE细胞层完整性差，纯度低，杂细胞较多。经过分离酶溶液处理后RPE细胞层培养后细胞如图3所示，细胞增殖能力强，杂细胞少，纯度高，能更快的形成RPE典型形态。未经分离酶溶液处理后RPE细胞层培养后细胞如图4所示，细胞增殖能力弱，杂细胞多，纯度低，形成RPE典型形态能力差。在上述实施例1-2中，RPE细胞层经过分离酶处理，其细胞层完整性、细胞纯度、细胞均一性、后续细胞增殖能力均大幅度提高。以上所述，仅为本发明的具体实施方案，本发明的保护范围并局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的即使范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。当前第1页1 2 3