一种高效提取干燥植物DNA的方法与流程

本发明涉及一种植物基因组DNA的提取方法，具体涉及一种高效提取干燥植物DNA的方法。

技术背景

从植物组织中提取DNA是进行分子生物学方面研究的第一步。高质量的基因组DNA是进行如SSR、ISSR分子标记的基础(张立荣,2002)。迄今为止，人们提出了诸多提取DNA的方法，目前最常用的提取方法是SDS法、CTAB法(Murry MG,1980)。

远距离采样一般无法对材料即刻提取DNA，通常采用硅胶脱水干燥保存。有部分研究表明，硅胶脱水干燥的样品中DNA有不同程度的降解，其提取质量远不如鲜样中提取效果(陈亮,2002；王经源,2002)。尤其枯萎的植物样品中DNA易被核酸内源酶降解，硅胶干燥后DNA降解程度更加严重，提取质量下降。因此，亟待开发一种能够适用于临近枯萎植物干燥样品的基因组DNA的通用方法以适应研究要求。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高效提取干燥植物样品DNA的方法，该方法通用、高效、安全和简便。

实现本发明目的的技术方案如下：

一种高效提取干燥植物DNA的方法，包括如下步骤：

取干燥植物材料，粉碎，加入CTAB裂解缓冲液和一定体积的RnaseA，涡旋振荡；于65℃水浴30-50min，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，颠倒混匀，离心，取上清，加入异丙醇沉淀DNA，离心，弃上清，用EB溶解沉淀，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，颠倒混匀，离心，取上清；加入等体积的BB1，颠倒混匀，将混合液转移至干净离心柱，离心；弃液体，加入适量的CB1，静置一定时间，离心；弃液体，加入适量的WB1，离心；弃液体，再加入适量的WB1，离心；弃液体，离心，彻底去除残留的WB1；用预热至60℃-70℃的EB洗涤离心柱；离心，收集所得离心液，即得植物基因组DNA。

本发明所述干燥植物材料包括叶片、根、茎等，优选为叶片。

本发明所述干燥植物材料的含水率低于5％。

优选地，本发明所述干燥植物(材料)包括山莨菪(Anisodus tanguticus)、

桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying)、四数獐牙菜(Swertia tetraptera Maxim.)、椭圆叶花锚(Halenia elliptica)。优选地，将粉碎后的植物材料置于无菌离心管总，再加入CTAB裂解缓冲液进行裂解。

本发明所述CTAB裂解缓冲液与本领域常规配方相同；具体如下：CTAB 20g/L，Nacl 1.4mol/L，EDTA 10mmol/L，Tris 100mmol/L，调节pH至8.0。

优选地，所述干燥植物材料与CTAB裂解缓冲液的质量体积比为30-50mg/1mL；进一步优选为30mg/1mL。

本发明在水浴反应过程中，每隔5-8min上下颠倒混合反应液。

本发明在采用异丙醇沉淀DNA时，是用预冷至-20℃的异丙醇；优选地，所述异丙醇的用量为混合液离心后上清液总体积的2/3。

本发明所述离心转速为10000-12000rpm，温度为4-15℃，离心时间为1-10min。

具体地，所述高效提取干燥植物DNA的方法，包括如下步骤：

(1)取粉碎的干燥植物材料30-50mg，加入已预热至65℃的CTAB裂解缓冲液1mL，再加入15ul RnaseA，于65℃水浴30min，每隔5min上下颠倒混匀；

(2)加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，轻颠倒混匀，15℃，12000rpm，离心10min；

(3)转移上清至干净的离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，轻颠倒混匀，15℃，12000rpm，离心10min；

(4)转移上清至干净的离心管中，加入上清液2/3体积的预冷至-20℃的异丙醇，轻颠倒混匀，于-20℃静置30min；

(5)于15℃，12000rpm，离心10min，弃上清，加入400ul EB溶解沉淀，加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，轻颠倒混匀，15℃，12000rpm，离心10min；

(6)转移上清至干净的离心管中，加入等体积BB1，轻颠倒混匀，将混合液转移至干净离心柱，15℃，12000rpm，离心5min；

(7)弃液体，加入500ul CB1，静置5min，15℃，12000rpm，离心5min；

(8)弃液体，加入500ul WB1，15℃，12000rpm，离心5min；重复本步骤至少一次；

(9)弃液体，15℃，12000rpm，离心5min，彻底去除残留的WB1；

(10)弃离心管，将离心柱放置在干净滤纸上风干5min；

(11)将离心柱转移到干净的离心管，向离心柱中心膜上加入40ul预热至60℃-70℃的EB，静置2min，15℃，12000rpm，离心2min；重复本步骤至少一次；

(12)弃离心柱，收集所得离心液，即得植物基因组DNA。

本发明所述EB、BB1，CB1、WB1、RnaseA均来自于北京全式金生物技术有限公司提供的DNA提取试剂盒(EasyPure Plant Genomic DNA Kit，目录号:EE111)。根据该试剂盒说明书的记载，EB、BB1，CB1、WB1分别为Elution Buffer，Binding Buffer 1，Clean Buffer 1，Wash Buffer 1。

与现有技术相对，本发明具有以下优点：

(1)利用本发明方法从干燥植物样品组织中获得的DNA量显著高于普通提取方法获得的DNA，且DNA纯度符合下游应用的要求。

(2)经PCR和酶切试验证明最终获得的DNA能够达到一般分子生物学研究的要求。

(3)本发明提取方法具有通用、高效和简便的特点。

附图说明

图1为本发明实施例1-4中提取的4种干燥植物叶片总DNA的电泳结果，图1中从左到右依次为：DNA maker(DL2000)；1：山莨菪；2：桃儿七；3：四数獐牙菜；4：椭圆叶花锚。

图2为本发明实施例1-4中提取的4种干燥植物DNA PCR电泳结果，图2中从左到右依次为：DNA maker(DL2000)；1：山莨菪；2：桃儿七；3：四数獐牙菜；4：椭圆叶花锚。

图3为本发明实施例1-4中提取的4种干燥植物DNA EcoRⅠ限制性酶切电泳结果，图3中从左到右依次为:DNA maker(Trans 2K plus II)；1：山莨菪；2：桃儿七；3：四数獐牙菜；4：椭圆叶花锚。

图4为本发明实验例3-4中提取的4种干燥植物叶片总DNA的电泳效果。图4中从左到右依次为：DNA maker(Trans 2K plus II)；1：山莨菪(CTAB法)；2：桃儿七(CTAB法)；3：四数獐牙菜(CTAB法)；4：椭圆叶花锚(CTAB法)；5：山莨菪(EE111)；6：桃儿七(EE111)；7：四数獐牙菜(EE111)；8：椭圆叶花锚(EE111)。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式做进一步详细描述，但并不局限于本发明，仅作示例说明。下列实施例中未注明具体实验的条件方法，通常按照常规条件，或者制造厂商所建议的条件。

本发明采用的氯仿、异戊醇和异丙醇优购于北京宏业图成科技有限公司。

本发明所述EB、BB1，CB1、WB1、RnaseA、RB1、BB1均来自于北京全式金生物技术有限公司提供的DNA提取试剂盒(EasyPure Plant Genomic DNA Kit，目录号:EE111)。

本发明中采用的缩略词语为：CTAB为溴化十六烷基三甲基铵(cetyltrimethylammonium bromide)、EDTA为乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid)

实施例1

本实施提供的山莨菪干燥叶片的DNA的提取过程如下：

(1)以干燥山莨菪叶片(含水率低于5％)为原料，采用植物组织研磨仪将叶片研磨成粉末，每个样品称取约30-50mg。余下的组织粉末保存于-80℃冰箱备用。

(2)称取30mg研磨后的样品，加入已预热至65℃的CTAB裂解缓冲液1mL，再加入15ul RnaseA，65℃水浴30min(每隔5min上下颠倒混匀)。

(3)加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，轻颠倒混匀，15℃，12000rpm，离心10min。

(4)转移上清至干净的离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，轻颠倒混匀，15℃，12000rpm，离心10min。

(5)转移上清至干净的离心管中，加入上清液2/3体积的(-20℃预冷的)异丙醇，轻颠倒混匀，于-20℃静置30min。

(6)于15℃，12000rpm，离心10min，弃上清，加入400ul EB溶解沉淀，加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，轻颠倒混匀，15℃，12000rpm，离心10min。

(7)转移上清至干净的离心管中，加入等体积BB1，轻颠倒混匀，将混合液转移至干净离心柱，15℃，12000rpm，离心5min。

(8)弃液体，加入500ul CB1，静置5min，15℃，12000rpm，离心5min。

(9)弃液体，加入500ul WB1，15℃，12000rpm，离心5min；重复本步骤一次。

(10)弃液体，15℃，12000rpm，离心5min，彻底去除残留的WB1。

(11)弃离心管，将离心柱放置在干净滤纸上风干5min。

(12)将离心柱转移到干净的离心管，向离心柱中心膜上加入40ul 60℃预热的EB，静置2min，15℃，12000rpm，离心2min，重复本步骤一次。

(13)弃离心柱，收集所得离心液，即得样品山莨菪基因组DNA。

实施例2

与实施例1的区别仅在于将植物原料替换为桃儿七的叶片(含水率低于5％)，制得样品桃儿七基因组DNA。

实施例3

与实施例1的区别仅在于将植物原料替换为四数獐牙菜的叶片(含水率低于5％)，制得样品四数獐牙菜基因组DNA。

实施例4

与实施例1的区别仅在于将植物原料替换为椭圆叶花锚的叶片(含水率为低于5％)，制得样品椭圆叶花锚基因组DNA。

上述实施例1-4提取的干燥枯萎植物基因组DNA的产率和ISSR

实验例1本发明方法提取4种干燥植物样品叶片DNA质量比较

采用紫外分光光度计(Merinton,SMA4000)分别测量DNA溶液在230nm、260nm、280nm的光吸收峰度值。通过计算OD260/OD280和OD230/OD260比值分别获得DNA溶液中蛋白、多糖、酚类以及RNA的污染度，从而估算DNA浓度。公式为：DNA样品浓度(ug/ul)＝OD260×稀释倍数×50

比较不同方法提取DNA的产率，琼脂糖凝胶电泳时每个样品上样3ulDNA溶液。1％琼脂糖(Invitrogen,California,美国)，1×TBE(上海生工)，GoldView(北京赛百盛基因技术有限公司)染色，100V，30min电泳，检测DNA。利用UPV紫外成像系统(EC3system,美国)扫描成像。

采用以上实施例1-4方法提取四种枯萎干燥植物叶片基因组DNA：山莨菪(Anisodus tanguticus)、桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying)、四数獐牙菜(Swertia tetraptera Maxim.)、椭圆叶花锚(Halenia elliptica)。从下表1和图1可以看到，本发明方法能够从上述样品中成功提取出DNA，紫外分光光度计检测结果表明提取获得的DNA纯度符合要求。

表1本发明方法提取4种枯萎干燥植物叶片DNA的质量比较

实验例2本发明方法提取的4种植物DNA的PCR验证和酶切实验

DNA的提取是分子生物学研究中至关重要的第一步。因此，DNA提取方法的试用性还需要下游实验的验证。本发明中，通过PCR和酶切进一步验证本发明提取方法所获得的DNA的质量。

通过PCR反应验证本发明方法所获得的DNA的质量。方法如下：25μLPCR反应体系包含有：12.5μL 2×Taq PCR Master Mix(Transgene)，上下游引物各0.5ul，2ul基因组DNA(浓度约为40ng/ul)，9.5ul ddH₂O。用于扩增ITS序列的一对通用引物的序列：ITS1(5’-AGAAGTCGTAACAAGGTTTC-3’)ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTTATATGC-3’)PCR扩增程序为：，95℃，5min预变性；95℃，变性30s；52℃，退火45s；72℃，延伸1min40s；35个循环，72℃，终延伸10min；15℃，停止反应。

20ul酶切体系包括：1ug DNA模板，2ul 10×FlyCut^TMBuffer，0.5ul EcoRⅠ酶(20unit/ul)(TransGene)。37℃，10min，65℃，20min。

利用ITS引物以本发明实施例1-4提取获得的上述4种植物基因组DNA为模板，进行PCR扩增，结果如图2所示。电泳结果显示从所有四个样品中都扩增出清晰的目的条带。PCR实验结果证明本发明提取方法获得的植物基因组DNA符合下游实验的要求。EcoRⅠ限制性酶切电泳结果如附图3所示，酶切获得的条带在凝胶上成均匀的弥散状分布，这表明本发明所获得的DNA纯度良好，符合酶切试验及下游实验的要求。

更为重要的是，本发明运用改良的CTAB法与全式金植物基因组DNA提取试剂盒相结合的方法，能够有效去除多酚和糖类物质对DNA提取的干扰，尤其适应于临近干燥或枯萎的植物干燥叶片，能够有效地富集DNA，并消除颜色对DNA的影响。PCR实验结果证明本发明提取方法获得的DNA能够达到下游实验的要求。

以上各实施例中采集的材料为临近枯萎的植物干燥叶片，另外，以上述植物或其他植物的根、茎为原料，采用上述本发明提取方法，同样可以获得符合要求的植物基因组DNA，此处不再一一举例说明。

实验例3

采用传统CTAB法提取山莨菪、桃儿七、四数獐牙菜以及椭圆叶花锚干燥叶片的DNA，山莨菪、桃儿七、四数獐牙菜以及椭圆叶花锚的干燥叶片分别与实施例1-4相同。

具体提取过程如下：

(1)分别以上述四种干燥植物叶片(含水率低于5％)为原料，采用植物组织研磨仪将叶片研磨成粉末。

(2)称取30mg研磨后的样品，加入已预热至65℃的CTAB裂解缓冲液1mL，20ulβ-巯基乙醇，15ul RnaseA，65℃水浴30min(每隔5min上下颠倒混匀)。

(3)加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，轻颠倒混匀，12000rpm，15℃，10min

(4)转移上清至干净的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)，轻颠倒混匀，12000rpm，15℃，10min

(5)转移上清至干净的离心管中，加入上清液2/3体积的(-20℃预冷的)异丙醇，轻颠倒混匀，-20℃，静置30min。

(6)于15℃，12000rpm，离心10min，弃上清，400ul去离子水溶解沉淀，加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，轻颠倒混匀，12000rpm，15℃，离心10min。

(7)转移上清至干净的离心管中，加入0.1倍体积的NaAC，2.5倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，上下颠倒，轻柔混匀，-20℃，沉降30min。

(8)12000rpm，15℃，离心10min，弃上清。

(9)75％乙醇漂洗沉淀，12000rpm，15℃，离心5min，弃上清。

(10)重复步骤(9)

(11)弃上清，将离心管放置超净台中吹干。

(12)50ul去离子水溶解沉淀，此溶液即为DNA，-20℃保存待用。

取3ul DNA溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，100V，30min。并用紫外分光光度计测定其浓度。结果见表2和图4。

实验例4

采用全式金植物基因组DNA提取试剂盒(目录号:EE111)提取山莨菪、桃儿七、四数獐牙菜以及椭圆叶花锚干燥叶片的DNA，山莨菪、桃儿七、四数獐牙菜以及椭圆叶花锚的干燥叶片分别与实施例1-4相同。

具体提取过程如下：

(1)分别以四种干燥植物叶片(含水率低于5％)为原料，采用植物组织研

磨仪将叶片研磨成粉末，每个样品称取约20mg。

(2)加入250μl溶液RB1，15μl RNase A充分混匀。

(3)55℃水浴孵育15min。

(4)15℃，12000rpm，离心5min。转移上清至新的离心管中。

(5)加入100ul溶液PB1，充分混匀，冰浴5min，15℃，12000rpm，离心5min。

(6)转移上清至一新的离心管中，加入375ul溶液BB1，充分混匀。

(7)吸取全部混合液体加入离心柱中，15℃，12000rpm，离心30s，弃液体。

(8)加入500ul溶液CB1，15℃，12000rpm，离心30s，弃液体。

(9)重复步骤(8)。

(10)加入500ul溶液WB1，15℃，12000rpm，离心30s，弃液体。

(11)重复步骤(10)。

(12)15℃，12000rpm，离心2min，彻底去除残留的WB1。

(13)将离心柱置于新的1.5ml离心管中，在柱的中央加入50ul EB缓冲液。室温静置1min，15℃，12000rpm，离心2min，洗脱DNA。

(13)为了得到浓度更高的DNA，进行第二次洗脱，将洗脱下来的DNA溶液重新上柱加入柱中央，室温静置1min，15℃，12000rpm，离心2min，洗脱DNA。

取3ul DNA溶液使用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，100V，30min。并用紫外分光光度计测定其浓度。结果见表2和图4。

从表2和图4可以看到，传统的CTAB方法以及全式金植物基因组DNA提取试剂盒(EE111)均不能从上述样品中成功提取出DNA，紫外分光光度计检测结果表明提取获得的DNA纯度较差，不符合下游实验要求。

表2 CTAB方法与EE111试剂盒提取4种枯萎干燥植物叶片DNA的质量比较

参考文献

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4.王经源,黄儒珠.用于DNA提取的刺桫椤叶片组织保存方法研究[J].福建师范大学学报:自然科学版,2002,18(1):82-85.

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。