本发明涉及植物栽培技术领域，具体涉及一种防治烟草疫霉病复合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
疫霉菌是一群重要的植物病原菌，该菌对寄主植物的破坏性强，危害性大。随着我国农业生产结构的改变，果树、蔬菜、花卉、中草药材以及设施农业的大量发展，植物疫病对农业生产的威胁日趋严重。长春花疫病病原菌为烟草疫病，温度28℃、空气相对湿度高于85%是该病发生流行的最适条件。花、茎、叶均可受害，病部初生灰褐色油渍状小斑，扩展后呈黑褐色不规则形状，潮湿条件下病部生白色稀疏霉层，发病严重时茎部倒折下垂，叶片和花受害后出现水渍状褐色斑，并易腐烂。由于疫霉菌是一种土传菌，在分类上属于卵菌，在进化关系上与真菌相距很远，大部分常规的杀真菌剂对疫霉菌无效，造成植物疫病较难防治，通常需要采取农业措施、抗病品种、化学防治等综合措施才能取得较好的防治效果，而生物防治则更符合人们对食品和环境安全的要求。
1）农业措施和抗病品种选育、推广轮作、调整作物播种期等农业措施可以减轻菌源，降低病害发生，是有效防治疫病发生的方法，其中利用植物抗性是最经济有效的的方法，对某些重要植物(如马铃薯)，应加强品种抗性评价鉴定、抗病品种的选育和推广工作；
2）加强田间或种植园管理田间或种植园湿度、持水量及植物密度直接影响着疫病的发生及流行，因此，对田块或种植园进行土地平整、及时排水、适当调整植物密度从而降低湿度有利于减轻疫病发生程度。此外，合理施肥，增强植物的抗病能力，也有利于减轻病情；
3）化学防治疫病也是目前最常用防治措施，苯酰胺类杀菌剂(PAFs)是防治疫霉菌的专用药剂。目前生产上防效较好、应用较多的农药有25%甲霉灵WP 和68%精甲霜·锰锌WP等，喷施均有较好的防治效果。由于苯酰胺类杀菌剂作用位点单一，很容易使病原菌发生突变，产生抗药性，因此需要针对不同地区疫霉菌( 生理小种) 分布、抗药性、致病力特点合理安排使用化学农药，避免单一农药的长时间使用，以防抗药性和交互抗性的产生；
植物病害生防菌已涉及真菌、放线菌、细菌、乃至病毒（噬菌体），生物防治是利用一种或多种生物或其代谢产物来降低植物病原物的数量或抑制其致病能力而减轻植物病害的一类措施，通过植物、病原物、生防菌、植物表面及其周围的有益微生物群落和自然环境等因素相互之间的互作关系，来达到促生防病的作用。引起植物病害的病原物种类很多，包括真菌、细菌、线虫、病毒等。它们通常侵染植物的根部，引起根部甚至全株的病害，从而造成重大的经济损失。拮抗菌主要有芽孢杆菌、假单胞杆菌和链霉菌等，芽孢杆菌是目前生防菌研究较多的一类，因其能够耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，是理想的生防菌筛选对象。芽孢杆菌的抑菌范围很广，包括根部病害、枝条病害、叶、花部病害和果实病害。已报道的有拮抗的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等。链霉菌是抗生素类物质的主要生产菌，在微生物产生的20000多种活性物质中，链霉菌占到60%以上，是一类作物有益菌。细黄链霉菌作为链霉菌属内的一个种类，在自然栽培条件下，其自身代谢产物可有效地促进植物生长，已广泛应用于果树、蔬菜等多种植物栽培上，并对蔬菜等作物具有明显的促生、抗病作用；
4）生物防治是病原菌与拮抗微生物之间相互作用的结果。拮抗微生物通过产生抑制病原菌的生长、孢子萌发或孢子形成的抗生素或有毒的代谢产物、直接寄生病原菌、与病原菌营养竞争等方式防治病害。不论是哪种抑制病害机理，拮抗菌的数量或活性都必须维持在抑制病害的阈值水平，如果拮抗菌的数量或活性低于这一阈值，那么烟草疫霉菌可能发展而引发病害。研究表明，对于抑制烟草疫霉的土壤来说，增加有益微生物数量有利于降低病害发生率或严重性，而这些有益微生物数量和活性是由土壤中起营养作用的有机物质所维持。在发病的关键时期，活性拮抗微生物能有效阻碍病原菌的发展，从而防治病害的发生。然而，近年来由于受到化肥肥效性的冲击，出现烟农少施有机肥、多施化肥的现象，导致土壤有机质含量下降和拮抗菌无法正常繁殖，因而很难大面积进行防治。生物防治随着人们对食品和环境安全问题的关注，生物防治将有望受到越来越多的重视和长足发展。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术中的不足，而提供一种防治烟草疫霉病复合菌剂及其制备方法和应用，采用该方法制得的防治烟草疫霉病复合菌剂能应用于防治烟草疫霉病。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种防治烟草疫霉病复合菌剂，主要由以下菌体制成：
细黄链霉菌、光合细菌、硝化细菌、固氮菌、解磷菌和解钾菌。
优选的，所述光合细菌、硝化细菌、固氮菌、解磷菌和解钾菌均为单菌落菌体。
本发明还提供上述防治烟草疫霉病复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
挑取细黄链霉菌加入高氏一号液体培养基中；挑取光合细菌接种到酵母膏液体培养基中；挑取硝化细菌、固氮菌、解磷菌和解钾菌的培养步骤加入马铃薯液体培养基中；各个培养基在20-35℃条件下发酵24-96h，待各培养基中菌体含量高于108cfu/ml即停止发酵，各培养基在120-180r·min-1条件下离心获得各菌液，将各菌液按等体积比混匀，制得所述复合菌剂。
优选的，各个培养基在28℃条件下发酵72h，待各培养基中菌体含量高于108cfu/ml即停止发酵，各培养基在150r·min-1条件下离心获得各菌液，将各菌液按等体积比混匀，制得所述复合菌剂。
作为本发明所述防治烟草疫霉病复合菌剂的优选实施方式，所述防治烟草疫霉病复合菌剂还包括枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。
作为本发明所述防治烟草疫霉病复合菌剂的优选实施方式，所述防治烟草疫霉病复合菌剂还包括绿色木霉、酿酒酵母、假丝酵母和解朊假丝酵母。
作为本发明所述防治烟草疫霉病复合菌剂的优选实施方式，所述枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、绿色木霉、酿酒酵母、假丝酵母和解朊假丝酵母均为单菌落菌体。
本发明还提供上述防治烟草疫霉病复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
挑取细黄链霉菌加入高氏一号液体培养基中；挑取细黄链霉菌加入高氏一号液体培养基中；挑取光合细菌接种到酵母膏液体培养基中；挑取硝化细菌、固氮菌、解磷菌和解钾菌的培养步骤加入马铃薯液体培养基中；挑取枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌单菌落分别加入牛肉膏蛋白胨液体培养基中；挑取绿色木霉、酿酒酵母、假丝酵母、解朊假丝酵母单菌落分别加入PDA液体培养基中；各个培养基在20-35℃条件下发酵24-96h，待各培养基中菌体含量高于108cfu/ml即停止发酵，各培养基在120-180r·min-1条件下离心获得各菌液，将各菌液按等体积比混匀，制得所述复合菌剂。
优选的，各个培养基在28℃条件下发酵72h，待各培养基中菌体含量高于108cfu/ml即停止发酵，各培养基在150r·min-1条件下离心获得各菌液，将各菌液按等体积比混匀，制得所述复合菌剂。
最后，本发明还提供上述防治烟草疫霉病复合菌剂在防治烟草疫霉病上的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述复合菌剂应用于防治长春花的烟草疫霉病。
本发明的有益效果：
本发明的一种防治烟草疫霉病复合菌剂，通过选取细黄链霉菌作为拮抗菌，选取光合细菌、硝化细菌、固氮菌、解磷菌以及解钾菌作为营养功能菌，使得其对烟草疫霉病病原菌形成一定的拮抗作用，能有效地预防烟草疫霉病的伤害。本发明的一种防治烟草疫霉病复合菌剂，可以直接植物种植使用，也可以应用于接种堆肥，生产生物有机肥。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
本发明实施例的光合细菌、硝化细菌、固氮菌、解磷菌、解钾菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、绿色木霉(Trichodermaviride)、巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)、酿酒酵母(Saccharomyces revisiae)、假丝酵母(Candida tropicalis)、解朊假丝酵母(Candida famata)均由华南农业大学新肥料资源研究中心提供，主要是物料腐熟、促进植物生长的有益微生物。
本发明实施例的细黄链霉菌，简称5406，购买于广东省微生物菌种保藏中心，GIM4.52。
实施例1
本发明实施例的防治烟草疫霉病复合菌剂，主要由以下菌体制成：
细黄链霉菌、光合细菌、硝化细菌、固氮菌、解磷菌和解钾菌，所有菌体均为单菌落菌体。当然，所述防治烟草疫霉病复合菌剂还可以包括其他拮抗菌，本实施例不做具体限定。
本发明实施例的防治烟草疫霉病复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
挑取细黄链霉菌加入高氏一号液体培养基中；挑取光合细菌接种到酵母膏液体培养基中；挑取硝化细菌、固氮菌、解磷菌和解钾菌的培养步骤加入马铃薯液体培养基中；各个培养基在25℃条件下发酵36h，待各培养基中菌体含量高于108cfu/ml即停止发酵，各培养基在140r·min-1条件下离心获得各菌液，将各菌液按等体积比混匀，制得所述复合菌剂。
本发明实施例的防治烟草疫霉病复合菌剂能应用于防治长春花的烟草疫霉病。
实施例2
本发明实施例的防治烟草疫霉病复合菌剂，主要由以下菌体制成：
细黄链霉菌、光合细菌、硝化细菌、固氮菌、解磷菌、解钾菌、枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，所有菌体均为单菌落菌体。当然，所述防治烟草疫霉病复合菌剂还可以包括其他拮抗菌，本实施例不做具体限定。
本发明实施例的防治烟草疫霉病复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
挑取细黄链霉菌加入高氏一号液体培养基中；挑取细黄链霉菌加入高氏一号液体培养基中；挑取光合细菌接种到酵母膏液体培养基中；挑取硝化细菌、固氮菌、解磷菌和解钾菌的培养步骤加入马铃薯液体培养基中；挑取枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌单菌落分别加入牛肉膏蛋白胨液体培养基中；各个培养基在28℃条件下发酵72h，待各培养基中菌体含量高于108cfu/ml即停止发酵，各培养基在150r·min-1条件下离心获得各菌液，将各菌液按等体积比混匀，制得所述复合菌剂。
本发明实施例的防治烟草疫霉病复合菌剂能应用于防治长春花的烟草疫霉病。
实施例3
本发明实施例的防治烟草疫霉病复合菌剂，主要由以下菌体制成：
细黄链霉菌、光合细菌、硝化细菌、固氮菌、解磷菌、解钾菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、绿色木霉、酿酒酵母、假丝酵母和解朊假丝酵母，所有菌体均为单菌落菌体。当然，所述防治烟草疫霉病复合菌剂还可以包括其他拮抗菌，本实施例不做具体限定。
本发明实施例的防治烟草疫霉病复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
挑取细黄链霉菌加入高氏一号液体培养基中；挑取细黄链霉菌加入高氏一号液体培养基中；挑取光合细菌接种到酵母膏液体培养基中；挑取硝化细菌、固氮菌、解磷菌和解钾菌的培养步骤加入马铃薯液体培养基中；挑取枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌单菌落分别加入牛肉膏蛋白胨液体培养基中；挑取绿色木霉、酿酒酵母、假丝酵母、解朊假丝酵母单菌落分别加入PDA液体培养基中；各个培养基在33℃条件下发酵84h，待各培养基中菌体含量高于108cfu/ml即停止发酵，各培养基在165r·min-1条件下离心获得各菌液，将各菌液按等体积比混匀，制得所述复合菌剂。
本发明实施例的防治烟草疫霉病复合菌剂能应用于防治长春花的烟草疫霉病。
试验例1
一、烟草疫霉病病原菌的制备：
1）分离：发病长春花采自广州市白云大道绿化带。取发病长春花茎部，切开，加入70%酒精表面杀毒3-5秒，转入3%次氯酸钠溶液3-5min，放入灭菌水中洗净，用灭菌滤纸吸干水分，放入PDA培养基，倒置培养，长出菌丝，挑出放入另外培养基培养。观察其菌落形态，并通过制作切片，显微镜观察。
2）致病性：取生长正常的长春花，茎基部用灭菌刀轻轻划开，将病原菌接入，用灭菌滤纸包好，保湿，以不接入病原菌为对照。每处理5株长春花，室温培养，观察其发病情况，对病株进行再分离，以明确供试病原菌的致病性。结果显示，长春花生长4d后，接种病原菌处理开始出现发病症状，茎基部出现黑斑，随着时间延长，茎基部逐渐坏死，并逐渐向上蔓延，纵剖病茎可见内部呈黑褐色，而且病株叶片自下而上依次变黄，萎蔫下垂，最终病株枯死。
二、试验设置4个处理，以不接种复合菌剂的基质为对照CK，分别按1%、3%和5%（质量比）接种本发明实施例1的复合菌剂的基质依次为T1、T2和T3。每组处理5个重复，每盆装入250g基质。于2016年4月12日播种长春花；5月12日移入花盆，每盆移栽3株幼苗；5月28日接种复合菌剂。6月19日观察长春花的生长及烟草疫病的发病情况。
从烟草疫霉病发病情况来看，不接种复合菌剂的基质种植长春花的发病株数为2株，分别按1%、3%和5%（质量比）接种复合菌剂的基质种植长春花未见发病病株。用接种本发明实施例1的复合菌剂的基质种植长春花具有防治烟草疫霉病的效果，其原因一方面来源于拮抗菌的直接拮抗作用，另一方面来源于生态位竞争、营养竞争的间接作用。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。