本发明属于食药用菌活性物质研究领域，涉及到在加入外源诱导物的条件下，即在液体发酵培养基中加入一定浓度的连翘醇提物来提高牛樟芝菌丝体总三萜含量的方法。
背景技术：
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樟芝（Antrodia camphorata）又名牛樟菇、樟窟内菇、红樟芝，隶属担子菌亚门（Basidiomycotina），层菌纲（Hymenomycetes），多孔菌科（Polyporaceae），薄孔菌属 （Antrodia），是一种原产于台湾的珍稀药用菌。牛樟芝原生于中国台湾山区海拔450～2000米之间特有的树龄百年以上的牛樟树（Cinnamomea kanehirai）树干腐朽心材的内壁，是台湾的地道药材，被称为“台湾瑰宝”、“台湾森林中的红宝石”。
牛樟芝含有丰富的活性物质，现在已知的超过78种化合物，包括三萜类(terpenoids)、苯酸类(benzenoids)、木脂素 (lignans)、苯醌及其衍生物(benzoquinone derivatives)、琥珀酸与马来酸及其衍生物( uccinic and maleic derivatives)及多糖体等。近年来牛樟芝在抗发炎、保肝、抗肝癌、抗肺癌、抗乳癌、抗卵巢癌、抗结肠癌、抗口腔癌、抗氧化、降低系统性红斑狼疮性肾炎及抗血小板凝集等方面的研究皆显示其未来具有高度发展潜力。牛樟芝口服 90 天亚急性毒性试验证明安全。
三萜类物质为牛樟芝的主要活性成分之一，且最为特别，高达200种以上，是其他菇菌无法相比的，具有抗癌、保肝等功效。药理研究表明三萜具有抗癌，抗炎，抗病毒和保肝等多种活性，牛樟芝对于酒后或宿醉的解酒效果非常显著。近年来已逐渐成为国内外研究和开发的热点。
现有技术的液体培养可以在较短时间内获得大量的牛樟芝菌丝体，能大大的提高产量，可以弥补牛樟芝生长缓慢这个缺点，但是其活性产物三萜类成分的含量很低，这是其难以代替固态培养的菌丝体和子实体的主要原因。
技术实现要素：
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本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种操作简单，原料易得，成本低，三萜含量得到明显提高的提高液体培养的牛樟芝菌丝体总三萜含量的方法。
本发明的目的可以通过如下措施来达到：一种提高液体培养的牛樟芝菌丝体总三萜含量的方法，其特征在于其包括如下步骤：
以液体菌种为基础
菌种：牛樟芝菌种，购于广东微生物菌种保藏中心，低温保存于PDA斜面培养基上。
菌种活化：采用胡萝卜培养基对保存的菌种进行活化。配制胡萝卜培养基，按重量百分比：15%-25%胡萝卜（切成1cm3 大小，沸水煮20min），1%-3%葡萄糖，1.5%-2.0%琼脂，余量水，pH自然。将低温保藏菌种在无菌条件下接入胡萝卜培养基，置于28℃恒温培养箱中培养10-20天。
液体种子制备：配制液体种子培养基，按重量百分比：将3%-10%的粉碎至无完整麦粒的麦芽加入沸水煮15min-30min，过滤，取滤液定容，pH自然。将配制好的液体种子培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装100 ml -200ml，食用菌专用封口膜封口，在121℃条件下灭菌30min，取出培养基，自然冷却至20~30℃；在无菌条件下每瓶接入2粒（黄豆粒大小）活化好的菌种，封口；置于旋转式摇床上转速120rpm、温度25℃-28℃条件下培养7-11天，成为牛樟芝液体种子。
连翘醇提液的制备：将烘干后的连翘研磨成20-100目粉末，称取20-50克加入烧杯中，加入十倍重量的重量浓度为95-100%的乙醇，封口，室温浸提48h以上，期间搅拌3-4次；连翘浸提完毕后，进行过滤浓缩，浓缩至原体积的十分之一，每克连翘药材得到1ml浓缩液。
液体发酵培养基制备：配制液体培养基，按重量百分比：将3%-10%的粉碎至无完整麦粒的麦芽加入沸水煮20min，过滤，取滤液定容，pH自然。将浓缩好的连翘醇提液按照生药干重的1%-2.5%诱导浓度作为诱导物加入液体培养基中，用500ml三角瓶，装量150ml/500ml瓶，用封口膜封好，放入灭菌锅中121℃，灭菌30min。
接种：待液体发酵培养基冷却后，在超净工作台中，将牛樟芝液体种子摇匀，酒精灯的火焰无菌区内将牛樟芝液体种子的培养基口打开，灼烧瓶口；在酒精灯的火焰无菌区内将液体发酵培养基口打开，灼烧瓶口，用移液枪按照接种量5%-10%吸取牛樟芝液体种子，接入液体发酵培养基中，封口，用棉绳扎紧；
培养管理：将接种完的培养瓶置于25℃-30℃的旋转式摇床中进行暗培养13-22天，过滤、烘干，得到总三萜含量大于6%的牛樟芝液体发酵菌丝体。
本发明同已有技术相比可产生如下积极效果：牛樟芝三萜类成分为真菌次生代谢产物，其合成机制复杂，受多种因素调控。申请人在研究牛樟芝菌丝体液体培养过程中三萜类成分产生规律的过程中，发现了中药连翘的醇提取物对牛樟芝菌丝体液体培养过程中三萜类成分产生有诱导作用，使液体培养的菌丝体中三萜类成分显著提高成为可能。其具有：
1、采用常见的中药连翘醇提物作为牛樟芝液体发酵的外源添加物，做到了创新的理念。通常牛樟芝液体发酵提高三萜类物质的含量一直是业界的技术难题，本发明采用加入中药连翘的醇提物对牛樟芝进行液体发酵培养，来提高牛樟芝液体发酵总三萜物质的含量，用比较简单的方法解决了这一难题。
2、牛樟芝液体发酵产三萜类物质的含量明显提高。一般牛樟芝液体发酵产三萜类物质的含量低于3%，而采用本发明得到的牛樟芝菌丝体总三萜含量能达到6%以上。
3、原料易得，成本低，操作简便易行。
具体实施方式：下面对本发明的具体实施方式做详细说明：
实施例1：以液体菌种为基础
菌种：牛樟芝菌种，购于广东微生物菌种保藏中心，低温保存于PDA斜面培养基上。
菌种活化：采用胡萝卜培养基对保存的菌种进行活化。配制胡萝卜培养基，按重量百分比：20%胡萝卜（切成1cm3 大小，沸水煮20min），2%葡萄糖，1.5%琼脂，余量水，pH自然。将低温保藏菌种在无菌条件下接入胡萝卜培养基，置于28℃恒温培养箱中培养15天。
液体种子制备：配制液体种子培养基，按重量百分比：将5%的粉碎至无完整麦粒的麦芽加入沸水煮20min，过滤，取滤液定容，pH自然。将配制好的液体种子培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装150ml，食用菌专用封口膜封口，在121℃条件下灭菌30min，取出培养基，自然冷却至20~30℃；在无菌条件下每瓶接入2粒（黄豆粒大小）活化好的菌种，封口；置于旋转式摇床上转速120rpm、温度26℃条件下培养10天，成为牛樟芝液体种子。
连翘醇提液的制备：将烘干后的连翘研磨成20-100目粉末，称取50克加入烧杯中，加入十倍重量的重量浓度为95-100%的乙醇，封口，室温浸提48h以上，期间搅拌3-4次；连翘浸提完毕后，进行过滤浓缩，浓缩至原体积的十分之一（50ml），每克连翘药材得到1ml浓缩液。
液体发酵培养基制备：配制液体培养基，将5%（重量百分比）的粉碎至无完整麦粒的麦芽加入沸水煮20min，过滤，取滤液将浓缩好的连翘醇提液按照生药干重的1.0%诱导浓度作为诱导物加入液体培养基中，定容，pH自然。用500ml三角瓶，装量150ml/500ml瓶，用封口膜封好，放入灭菌锅中121℃，灭菌30min。
接种：待液体发酵培养基冷却后，在超净工作台中，将牛樟芝液体种子摇匀，酒精灯的火焰无菌区内将牛樟芝液体种子的培养基口打开，灼烧瓶口；在酒精灯的火焰无菌区内将液体发酵培养基口打开，灼烧瓶口，用移液枪按照接种量5%吸取牛樟芝液体种子，接入液体发酵培养基中，封口，用棉绳扎紧。
培养管理：将接种完的培养瓶置于25℃的旋转式摇床中进行暗培养18天，过滤、干燥，测定牛樟芝液体发酵菌丝体中的总三萜含量为6.18%。
实施例2：以液体菌种为基础
菌种：牛樟芝菌种，购于广东微生物菌种保藏中心，低温保存于PDA斜面培养基上。
菌种活化：采用胡萝卜培养基对保存的菌种进行活化。配制胡萝卜培养基，按重量百分比：25%胡萝卜（切成1cm3 大小，沸水煮20min），3%葡萄糖，2%琼脂，余量水，pH自然。将低温保藏菌种在无菌条件下接入胡萝卜培养基，置于28℃恒温培养箱中培养10天。
液体种子制备：配制液体种子培养基，按重量百分比：将10%的粉碎至无完整麦粒的麦芽加入沸水煮30min，过滤，取滤液定容，pH自然。将配制好的液体种子培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装200ml，食用菌专用封口膜封口，在121℃条件下灭菌15min，取出培养基，自然冷却至20~30℃；在无菌条件下每瓶接入2粒（黄豆粒大小）活化好的菌种，封口；置于旋转式摇床上转速120rpm、温度28℃条件下培养6天，成为牛樟芝液体种子。
连翘醇提液的制备：将烘干后的连翘研磨成20-100目粉末，称取20克加入烧杯中，加入十倍重量的重量浓度为95-100%的乙醇，封口，室温浸提48h以上，期间搅拌3-4次；连翘浸提完毕后，进行过滤浓缩，浓缩至原体积的十分之一（20ml），每克连翘药材得到1ml浓缩液。
液体发酵培养基制备：配制液体培养基，将10%（重量百分比）的粉碎至无完整麦粒的麦芽加入沸水煮20min，过滤，取滤液将浓缩好的连翘醇提液按照生药干重的1.5%诱导浓度作为诱导物加入液体培养基中，定容，pH自然。用500ml三角瓶，装量150ml/500ml瓶，用封口膜封好，放入灭菌锅中121℃，灭菌30min。待液体发酵培养基冷却后，在超净工作台无菌操作接种1mL牛樟芝液体种子。
接种：待液体发酵培养基冷却后，在超净工作台中，将牛樟芝液体种子摇匀，酒精灯的火焰无菌区内将牛樟芝液体种子的培养基口打开，灼烧瓶口；在酒精灯的火焰无菌区内将液体发酵培养基口打开，灼烧瓶口，用移液枪按照接种量8%吸取牛樟芝液体种子，接入液体发酵培养基中，封口，用棉绳扎紧。
培养管理：将接种完的培养瓶置于27℃的旋转式摇床中进行暗培养22天，过滤、干燥，获得的牛樟芝液体发酵菌丝体中的总三萜含量为6.35%。
实施例3：以液体菌种为基础
菌种：牛樟芝菌种，购于广东微生物菌种保藏中心，低温保存于PDA斜面培养基上。
菌种活化：采用胡萝卜培养基对保存的菌种进行活化。配制胡萝卜培养基，按重量百分比：15%胡萝卜（切成1cm3 大小，沸水煮20min），1%葡萄糖，1.5%琼脂，余量水，pH自然。将低温保藏菌种在无菌条件下接入胡萝卜培养基，置于28℃恒温培养箱中培养20天。
液体种子制备：配制液体种子培养基，将3%（重量百分比）的粉碎至无完整麦粒的麦芽加入沸水煮30min，过滤，取滤液定容，pH自然。将配制好的液体种子培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装100ml，食用菌专用封口膜封口，在121℃条件下灭菌30min，取出培养基，自然冷却至20~30℃；在无菌条件下每瓶接入2粒（黄豆粒大小）活化好的菌种，封口；置于旋转式摇床上转速120rpm、温度25℃条件下培养11天，成为牛樟芝液体种子。
连翘醇提液的制备：将烘干后的连翘研磨成20-100目粉末，称取30克加入烧杯中，加入十倍重量的重量浓度为95-100%的乙醇，封口，室温浸提48h以上，期间搅拌3-4次；连翘浸提完毕后，进行过滤浓缩，浓缩至原体积的十分之一（30ml），每克连翘药材得到1ml浓缩液。
液体发酵培养基制备：配制液体培养基，将3%（重量百分比）的粉碎至无完整麦粒的麦芽加入沸水煮20min，过滤，取滤液将浓缩好的连翘醇提液按照生药干重的2.5%诱导浓度作为诱导物加入液体培养基中，定容，pH自然。用500ml三角瓶，装量150ml/500ml瓶，用封口膜封好，放入灭菌锅中121℃，灭菌30min。待液体发酵培养基冷却后，在超净工作台无菌操作接种1mL牛樟芝液体种子。
接种：待液体发酵培养基冷却后，在超净工作台中，将牛樟芝液体种子摇匀，酒精灯的火焰无菌区内将牛樟芝液体种子的培养基口打开，灼烧瓶口；在酒精灯的火焰无菌区内将液体发酵培养基口打开，灼烧瓶口，用移液枪按照接种量10%吸取牛樟芝液体种子，接入液体发酵培养基中，封口，用棉绳扎紧。
培养管理：将接种完的培养瓶置于30℃的旋转式摇床中进行暗培养14天，过滤、干燥，获得的牛樟芝液体发酵菌丝体中的总三萜含量为6.39%。
以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。