本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗25羟基维生素D3单克隆抗体和应用。
背景技术：
：维生素D3是胆固醇的衍生物，也称胆钙化醇，其活性形式有25-羟维生素D3(25-(OH)2-VitD3)，1,25-二羟维生素D3(1,25-(OH)2-VitD3)两种。25-羟维生素D3是维生素D的主要循环形式，1,25-二羟维生素D3为主要活性形式。VitD3无生物活性，它首先在肝脏被25-羟化酶催化为具有一定生物活性的25-(OH)-VitD3，然后在肾近端小管1α-羟化酶的催化下生成活性更高的1,25-(OH)2-VitD3。血液中各种形式的VitD3都与VitD结合蛋白结合，形成结合型VitD在血中运输。血浆中25-OH-VitD3的浓度为40～90mmol/L，而1,25-(OH)2-VitD3的含量为100pmol/L，半衰期为12～15h，其灭活主要在靶细胞内发生侧链氧化或羟化，形成钙化酸等代谢产物，这些产物在肝脏与葡萄糖醛酸结合后随胆汁排入小肠，在小肠，其中一部分被吸收入血，从而形成VitD3的肝肠循环，一部分随粪便排出体外。25羟基维生素D3的临床应用主要包括1.维生素D与儿童健康：血清25-OH-VD是维生素营养状况的最佳指标，应逐步开展。血清25-OH-VD是维生素D不足、轻度维生素D缺乏和佝偻病早期的主要诊断依据。2.维生素D与心血管：心血管疾病患者体内25羟基维生素D水平明显低于正常人,心衰患者降低程度更为明显,可通过补充维生素D降低心血管疾病的发病率。3.维生素D与孕妇健康：孕中晚期维生素D水平不足或缺乏是普遍现象，孕期应注意补充维生素D治疗，存在明显VitD缺乏，应补充VitD，维持25-OH-VD达正常范围。母亲血清25-OH-VD水平小于37.5nmol/L,剖腹产率增加4倍。4.维生素D与高血压：在一项研究中，南澳大利亚大学的研究人员对146，500名欧洲、北美后裔的健康信息进行分析后发现，体内维生素D浓度每上升10％，出现高血压风险就会下降8％。免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法，开发25羟维生素D3的酶联免疫试剂盒和胶体金检测试纸条关键是能够制备出对25羟维生素D3具有高亲和力和高特异性的抗体。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供了一种分泌抗25羟基维生素D3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能产生高效价的抗25羟基维生素D3单克隆抗体。一种分泌抗25羟基维生素D3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株6B5.2，已于2016年3月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCCNo.C201648；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。本发明采用小剂量肌肉注射免疫方法和腹腔免疫相结合的方法，利用25羟基维生素D3人工抗原注射小鼠，获得免疫的小鼠脾细胞，进而将免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，从而获得所述杂交瘤细胞株。25羟基维生素D3本身的分子量太小，不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，因此本发明对25羟基维生素D3进行化学修饰，偶联BGG(牛血清丙种球蛋白)获得能诱导B细胞的增殖和分化继而产生特异性抗体的25羟基维生素D3人工抗原。所述25羟基维生素D3的分子结构式如式(Ⅰ)所示：每次注射时，25羟基维生素D3人工抗原的用量为15μg。采用小剂量肌肉注射免疫方法和腹腔免疫相结合的方法免疫小鼠，免疫效价高。本发明还提供了上述杂交瘤细胞株在制备25羟基维生素D3检测试剂盒中的应用；或在制备用于检测25羟基维生素D3的试纸条中的应用。将所述杂交瘤细胞株6B5.2扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中可得到高效价的抗25羟基维生素D3单克隆抗体，利用该抗25羟基维生素D3单克隆抗体可用于制备25羟基维生素D3检测试剂盒。本发明的第二个目的是提供一种抗25羟基维生素D3单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株6B5.2或其传代细胞株分泌产生。该抗体的亚型为IgG2a，轻链为Kappa链。本发明的第三个目的是提供上述抗25羟基维生素D3单克隆抗体制备25羟基维生素D3检测试剂盒中的应用；或在制备用于检测25羟基维生素D3的试纸条中的应用。作为优选，所述检测试剂盒为竞争抑制ELISA检测试剂盒；其内还含有25羟基维生素D3标准品和酶标二抗。由于25羟基维生素D3本身分子结构的限制，本发明的检测试剂盒是以竞争抑制ELISA原理制备的。使用时，先包被25羟基维生素D3标准品，再加入待测样品，然后依次加入所述抗25羟基维生素D3单克隆抗体、酶标二抗，进行反应，检测OD值，计算竞争抑制率。25羟基维生素D3标准品的包被量以所述抗25羟基维生素D3单克隆抗体对25羟基维生素D3的检测限为宜。所述酶标二抗可选用羊抗鼠IgG-HRP。所述检测试剂盒为竞争型酶联免疫试剂盒；其内含有包被有抗25羟基维生素D3单克隆抗体的酶标板、25羟基维生素D3标准品、酶标抗原、底物和终止液。使用时，待检测样品和酶标记的25羟基维生素D3抗原一起加入酶标板反应，若样品中残留有25羟基维生素D3，则会与酶标25羟基维生素D3抗原竞争结合板上的抗体，再加入底物反应，终止显色。显色强度与样品中残留的25羟基维生素D3量成反比。根据25羟基维生素D3标准品做出的标准曲线，计算出样品中的25羟基维生素D3的含量。所述的试纸条包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫，所述标记物垫包被有胶体金标记或酶标记的抗25羟基维生素D3单克隆抗体。本发明的试纸条中，所述反应膜的检测线(T线)处包被有25羟基维生素D3-牛血清白蛋白复合物，所述反应膜的质控线(C线)处包被有二抗。所述酶标二抗可选用羊抗鼠IgG。本发明的试纸条也是以竞争抑制ELISA原理制备的，25羟基维生素D3-牛血清白蛋白复合物的包被量也是以所述抗25羟基维生素D3单克隆抗体对25羟基维生素D3的检测限为宜。检测时，若只有C线显色，表示待测样品中含有25羟基维生素D3且检测25羟基维生素D3的含量高于检测限；若C线和T线均显色，表示待测样品中检测25羟基维生素D3的含量低于检测限，或待测样品中无25羟基维生素D3；若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明利用自行设计的25羟基维生素D3人工抗原免疫小鼠，利用免疫的小鼠脾细胞制备获得杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的抗25羟基维生素D3单克隆抗体，效价高，特异性强，可用于对25羟基维生素D3进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。说明书附图图1为本发明一种25羟基维生素D3胶体金检测试纸条的结构示意图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。实施例1杂交瘤细胞株的制备(1)小鼠免疫选择8周龄的BALB/c雌鼠用25羟基维生素D3人工抗原10μg与quickantibody-5w佐剂等体积混合成100μl，注射小鼠后小腿肌肉；所述的后小腿肌肉部位为小鼠腿部暴露在外部有大块肌肉的地方，而小鼠的大腿大部分被腹部皮肤包裹，也可找到膝关节区分小腿大腿；两周后同样方式注射第2针；再2周后，用10μg抗原进行腹腔注射。(2)制备淋巴细胞取经步骤(1)处理的BALB/c雌鼠的脾脏，研磨脾脏细胞至悬液；淋巴细胞悬液离心，取沉淀；在沉淀中加入含有15％胎牛血清的IMDM培养基，调整淋巴细胞至10ml；加入25羟基维生素D3人工抗原至终浓度100μg/ml孵育培养6小时。(3)淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合：(3-1)饲养细胞制备：小鼠摘眼球处死，浸泡于75％酒精中消毒10min，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，用无菌注射器注入8mL37℃预热的IMDM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；1500rpm下离心3min，沉淀物用1×HAT的IMDM培养液重悬，得到饲养细胞悬液。(3-2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为10％的FBS的IMDM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代，以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长状态良好用于细胞融合。(3-3)淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合：将调整浓度后的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞个数比为2：1混合均匀，1500rpm下离心洗涤细胞1次，去除上清液，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀松动，置于37℃水浴，在90s内缓缓加入1mL37℃预温的1mLPEG1450，边加边轻微摇动；加入25ml37℃预温的IMDM无血清培养基终止PEG作用；1000rpm下离心5min，取沉淀；然后在沉淀中加入步骤(3-1)制备的饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。(4).杂交瘤细胞的融合筛选(4-1)初筛：步骤(3-3)中融合细胞在5％CO2培养箱中培养3天后，换用1×HT的IMDM培养液，继续培养4天后，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇(在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小以占满1/3视野为宜)时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。间接ELISA方法的操作步骤是：①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释25羟基维生素D3抗原至1μg/mL，96孔酶标板每孔中分别加入100μl稀释后的25羟基维生素D3人工抗原，4℃包被过夜，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；②将PBS缓冲液加入到融合细胞培养上清液稀释至25倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的融合细胞培养上清液，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；④每孔加入50μl底物TMB，37℃下反应8分钟；⑤加入50μl浓度为2M的H2SO4终止反应，在450nm下测定其OD值，以融合细胞培养上清液OD450值/阴性对照OD450值>2.5为阳性克隆，将筛选到的阳性克隆进一步地用竞争抑制ELISA方法进行复筛。(4-2)复筛：竞争抑制ELISA方法的操作步骤是：①先将50μl浓度为30ng/ml的25羟基维生素D3标准品加入酶标孔中，再加入50ul阳性克隆培养上清液，同时设计空白对照，即50μlPBS缓冲液和50μl阳性克隆培养上清液混合加入到酶标孔中，37℃孵育60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；②将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃下孵育30分钟，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；③每孔加入50μl底物TMB，37℃下反应8分钟；④加入50μl浓度为2M的H2SO4终止反应，在450nm下测定其OD值，计算竞争抑制率，结果如表1所示。竞争抑制率的计算式为：表1各杂交瘤细胞株的竞争抑制ELISA结果由表1可见，杂交瘤细胞株6B5的竞争抑制率最高，故挑取杂交瘤细胞株6B5做克隆培养。(4-3)杂交瘤细胞株6B5的克隆化杂交瘤细胞株6B5的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含体积分数为15％的FBS的IMDM培养基稀释成4个/mL的细胞悬液，然后以每孔200μl接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况，并检测细胞培养板中细胞培养上清液的抗体水平，选择3个抗体效价最高的单克隆，再次做克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率达到100％；然后挑取单克隆细胞，命名为6B5.2，扩大培养后进行抗25羟基维生素D3单克隆抗体纯化。(5)抗25羟基维生素D3单克隆抗体纯化取扩大培养后的杂交瘤细胞株6B5.2，接种1×106细胞于小鼠腹腔，10天后采集腹水。取12ml腹水，用2倍体积的PBS稀释，再加入3倍体积的饱和硫酸铵，将得到混合液离心，取沉淀。沉淀用pH7.4的PBS溶解，然后用pH7.4的PBS透析过夜4次。收集抗体溶液，过滤。用OD280测定蛋白含量,蛋白浓度为3.47mg/ml。实施例2抗25羟基维生素D3单克隆抗体的反应活性测试采用间接ELISA方法检测实施例1制备的抗25羟基维生素D3单克隆抗体的反应活性，检测步骤包括：①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释25羟基维生素D3人工抗原至500ng/mL，然后在96孔酶标板中分别加入100μl/每孔稀释后的25羟基维生素D3人工抗原，4℃包被过夜；②用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后加入100μl浓度为0.3μg/ml的抗25羟基维生素D3单克隆抗体溶液，做1:3稀释，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中加入100μl/每孔稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后每孔加入50μl底物TMB37℃反应8分钟后，浓度为2M的H2SO4终止反应，450nm测定其OD值，以抗25羟基维生素D3单克隆抗体溶液OD450值/阴性对照OD450值>2.5为阳性值；检测结果见表2。表2不同浓度下抗25羟基维生素D3单克隆抗体的OD450值抗25羟基维生素D3单克隆抗体浓度OD450值0.3μg/ml1.8350.1μg/ml1.5410.03μg/ml1.0240.01μg/ml0.5860.003μg/ml0.3110.001μg/ml0.127PBS(空白对照)0.062由表2可见，实施例1制备的抗25羟基维生素D3单克隆抗体反应活性可以到达0.003μg/ml。实施例3如图1所示，本实施例一种25羟基维生素D3胶体金检测试纸条，包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾搭接在底板上。其中，胶体金垫上包被有胶体金标记的实施例1制备的抗25羟基维生素D3单克隆抗体，硝酸纤维素膜的检测线(T)处包被有25羟基维生素D3-牛血清白蛋白复合物，质控线(C)处包被有羊抗鼠IgG。25羟基维生素D3-牛血清白蛋白复合物的包被量为抗25羟基维生素D3单克隆抗体对25羟基维生素D3的检测限(以30ng/ml为例)。试纸条的制备方法为本领域的常规方法。检测时，室温下将试纸条样品垫的一端插入待测样品中，注意待测样品的液面不要超过试纸条上的MAX线；肉眼观察，并记录C线和T线的显色情况。若只有C线显色，表示待测样品中含有25羟基维生素D3且检测25羟基维生素D3的含量高于30ng/ml；若C线和T线均显色，表示待测样品中检测25羟基维生素D3的含量低于30ng/ml，或待测样品中无25羟基维生素D3；若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。当前第1页1 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