一种三叶青提取物体外诱导扩增人CD3AK细胞的方法和用途与流程

本发明涉及一种三叶青提取物体的用途，尤其是利用低浓度三叶青提取物能够增殖人CD3AK细胞的原理，来制备杀伤肿瘤的药物的用途，属于医药技术领域。

背景技术：

近年来，肿瘤的生物治疗已经成为肿瘤治疗领域研究的热点。其中，CD3AK细胞是一类以CD3⁺CD8⁺T为主的异质群细胞，具有扩增能力强、体外存活时间长、细胞毒性活性高、分泌细胞因子能力强等显著优点，已经被用于临床的抗肿瘤的细胞免疫治疗。CD3AK细胞主要以组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)非限制性或限制性方式识别肿瘤，通过颗粒酶B(granzyme B)和穿孔素(perforin)等途径杀伤肿瘤细胞，并与其它固有免疫细胞和适应性免疫细胞相互作用，辅助发挥抗肿瘤作用。人CD3AK细胞已经成为肿瘤患者过继免疫治疗重要的效应细胞。同时，CD3AK细胞还能与其它固有免疫细胞和适应性免疫细胞相互作用，协同发挥抗肿瘤作用。由此可见，有效扩增人外周血CD3AK细胞，以满足CD3AK细胞生物学功能研究和临床过继免疫治疗的需要，提高CD3AK细胞增殖率和功能是十分重要和必要的。

三叶青为葡萄科崖爬藤属，为植物三叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)的干燥块根，又名金丝吊葫芦等，是我国的特有植物，主要分布于中国东南地区民间的常用药物。三叶青的有效成分主要为含黄酮类化学成份，其性凉，味辛、苦，无毒，具有清热解毒、活血止痛、祛风化痰、活血止痛等功效，常用于高热惊厥，小儿感冒发热、喉痒肿痛、咳嗽、肺炎、肝炎、肠炎、痢疾等疾病。现代药理研究表明，三叶青提取物具有较好的抗肿瘤、抗炎、镇痛及解热作用等，参考文献如：1、资古明,吉兰,胡建成,等.金钱吊葫芦消炎镇痛的药理研究〔J〕.中草药，1989，20(2)：27-29；2、Cai X.LA study of Tetrastigma hemsleyanum on liver functions of rabbit by the application of 131I-rose bengal〔J〕.Chin Tradit Herb Drugs，1980，11(1):38-41；3、丁丽，纪其雄，吕雯婷等.三叶青水提物体内、体外抗肿瘤作用的研究.中成药.2013，35(5)：1076-1078；

并且，三叶青提取物对肿瘤细胞具有抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用。一些运用三叶青为主药用于肿瘤临床,发现在抑制肿瘤生长,延缓病人的生命,改善生命征象方面有独特的效果。王静等发现三叶青提取物能通过Caspase-3途径诱导人肝内胆管癌HCCC-9810细胞凋亡。余纳等研究发现三叶青总黄酮能通过Wnt/β-catenin通路抑制结肠癌细胞周期及增殖。在体内，三叶青提取物也表现出了较强的抗瘤活性。王明义等对裸鼠进行肝癌HepG2皮下移植瘤造模，用三叶青乙酸乙酯提取物进行干预治疗，结果发现该提取物能抑制肿瘤生长，且高剂量组能显著提高IFN-水平。徐彩菊等制造小鼠S180移植瘤模型，然后灌胃给于三叶青提取物，结果发现三叶青提取物高剂量组抑瘤率达36％，且小鼠外周血T细胞亚群CD3、CD4、CD8均有改善趋于正常。

许多实验室研究发现，能抑制肿瘤细胞增殖的三叶青提取物的用量大多在10mg/ml左右，但是，这一结果与临床实际用量明显不符。我们的研究发现，虽然高浓度三叶青提取物能抑制肿瘤细胞生长，但相同浓度三叶青提取物对人正常免疫细胞(包括αβT细胞、NK细胞和γδT细胞等)也有明显的抑制作用，说明高浓度三叶青提取物对肿瘤的抑制与药物细胞毒性相关，而非药物诱导的程序性死亡。同时发现，三叶青在体内的抗肿瘤作用可能与激发体内免疫细胞(包括CD3AK细胞)功能有关。

因此，本发明通过研究三叶青提取物诱导培养人CD3AK细胞增殖，来发现三叶青提取物新的医药用途，可为肿瘤免疫治疗药物研发提供实验参考。

技术实现要素：

针对上述现存的技术问题，本发明提供一种三叶青提取物的新医药用途，利用低浓度三叶青提取物来提高CD3AK细胞增殖率和功能，从而制备杀伤肿瘤细胞药物。

为实现上述目的，本发明提供一种三叶青提取物体外诱导扩增人CD3AK细胞的方法，包括如下具体步骤：

A、取健康人外周抗凝血，分离得到单个核细胞PBMC，将PBMC置于RPMI-1640培养液中，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养7d。

进一步，所述的RPMI-1640培养液包括小牛血清100ml/L、AB血浆50ml/L、anti-CD31μg/ml、rhIL-21000IU/ml。

B、取上步培养后的人CD3AK细胞配成5×10⁴/mL的细胞悬液，加入三叶青提取物，培养48h。

进一步，所述的三叶青提取物为经有机溶剂提取后的三叶青药材用水煮后减压回收蒸干制得的三叶青水提物Th-w4，浓度为0.15-2.44μg/ml。

本发明还提供一种三叶青提取物体制备杀伤肿瘤细胞药物的用途，药物杀伤肿瘤细胞的功效是三叶青提取物通过促进人CD3AK细胞的增殖，提高人CD3AK细胞的杀伤活性来实现的。

进一步，所述的三叶青提取物为经有机溶剂提取后的三叶青药材用水煮后减压回收蒸干制得的三叶青水提物Th-w4。

更进一步，所述的药物含有三叶青提取物的浓度为0.15-2.44μg/ml。

目前，国内有荷小鼠经三叶青提取物治疗后提高体内T细胞功能的报道，无用三叶青提取物在体外诱导培养人CD3AK细胞研究，无三叶青对CD3AK细胞增殖试验和对其穿孔素、颗粒酶B和CD107a表达和Western Blot法检测Bcl-2的实验研究。而经过上述研究可知，低浓度三叶青提取物能够显著促进人CD3AK细胞的增殖，促进其穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达，增加凋亡蛋白Bcl-2表达，明显提高CD3AK细胞的杀伤活性，并具有一定的剂量依赖性，不仅能够体外诱导扩增人CD3AK细胞，还能够实现制备杀伤肿瘤细胞药物的用途，为肿瘤免疫治疗药物研发提供了重大的实验参考价值。

附图说明

图1为实施例1中三叶青提取物的提取技术路线；

图2为实施例2中培养前的CD3AK细胞的表型；

图3为实施例2中培养后的CD3AK细胞的表型；

图4为实施例2中不同浓度三叶青水提物对CD3AK细胞增殖的影响；

图5为实施例3中不同浓度三叶青水提取物对三株肿瘤细胞的抑制率；

图6为实施例4中不同浓度三叶青水提物对GranB、Perforin、CD107a表达的影响

图7-1为实施例4中的同型对照；

图7-2为实施例4中空白对照组的GranB表达；

图7-3为实施例4中三叶青水提物浓度为0.15μg/ml组的GranB表达；

图8为实施例4中三叶青水提物诱导的CD3AK细胞对肿瘤细胞杀伤活性的影响；

图9为实施例5中三叶青水提物对CD3AK细胞Bcl-2表达的影响.

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1：三叶青药材的提取分离。

1-1实验材料：三叶青干燥块根(宁波市鄞州医药药材公司)；80％大孔吸附树脂树色谱仪；Yanaco显微熔点测定仪(温度计未校正)；Varian MAT-212型质谱仪；Bruker-speckospin AC-600P型核磁共振仪；薄层色谱硅胶板与柱色谱硅胶(100-200目、200-300目)(山东烟台江友硅胶开发公司)；Sephadex LH-20(20-80μm)(Pharmacia公司)；ODS C18反相硅胶(Merck公司)；提取用乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇为药用级，水为蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

1-2实验方法：三叶青提取物的提取方法参照文献[杨阳。甘西鼠尾草及头花蓼化学成分研究。第二军医大学硕士学位论文。上海：第二军医大学，2009]，如图1所示，根据提取时所选用的制剂将提取液分为9组，分别命名为：TH-t、TH-p、TH-a、TH-b、TH-w、TH-w1、TH-w2、TH-w3和TH-w4，本发明所需的是三叶青水提物(含糖)TH-w4。

取三叶青干燥药材200g，加5倍体积80％乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干，得总提取物TH-t。然后将乙醇提取后的三叶青干燥块茎水煮，减压回收蒸干，获得三叶青水提物(含糖)TH-w4共2.1克。

实施例2：三叶青水提取物TH-w4对CD3AK细胞增殖的影响。

2-1实验材料：三叶青块根(宁波市鄞州医药药材公司)；FITC-CD8、PerCP-Cy5.5-CD3、PE-Granzyme B(GranB)、PE-Perforin、APC-CD107a(BD公司)；CCK-8试剂盒(碧云天生物技术研究所)；Anti-CD3、重组人白细胞介素-2(rhIL-2)(厦门特宝生物工程股份有限公司)；GAPDH、Bcl-2(Abcam.)；人AB型血浆(徐州市血站)；CD3AK细胞培养基(浙江博纳生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑蓝(methlthiazolyl tetrazolium,MTT)和二甲基亚砜(dimethyl sμlfoxide DMSO)(Sigma公司)；淋巴细胞分离液(中国科学院血液病研究所)；乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒(日本世诺临床诊断制品株式会社)；Encore自动生化分析仪(北京希亚克技术有限公司)；荧光倒置显微镜TE2000-S(日本Nikon公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；流式细胞仪分析软件Cell Quest，每个标本分析细胞数≥l×10⁴。

2-2实验方法。

2-2-1CD3AK细胞培养及鉴定。

取健康人外周抗凝血20ml，常规分离得到单个核细胞(PBMC)，将PBMC置于含100ml/L小牛血清、50ml/L AB血浆、anti-CD3(1μg/ml)、rhIL-2(1000IU/ml)的RPMI-1640培养液中，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养7d，标记FITC-CD8和PerCP-Cy5.5-CD3，避光孵育15min，PBS洗涤一次，重悬于0.5ml PBS中，流式细胞仪检测其表达。

2-2-2CCK8法检测不同浓度三叶青水提物对人CD3AK细胞生长的影响。

取上步培养7d的CD3AK细胞配成5×10⁴/mL的细胞悬液。实验组：共设11个浓度组，分别加入5×10⁴/mL的CD3AK细胞，180μl/孔；然后加入不同浓度的三叶青水提物TH-w4(终浓度分别为0.002、0.01、0.04、0.15、0.61、2.44、9.77、39.06、156.3、625、2500μg/ml)，每组设5个复孔，同时设不加药物空白对照组，于培养箱中培养48h。培养结束前4个小时每孔加入CCK820μl，继续培养4h后于酶标仪450nm处检测各孔吸光值(OD)记录结果。

并且，增殖率(％)＝(实验OD值)—(对照OD值)/(对照OD值)×100％。

统计方法采用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料使用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，检验水准α＝0.05，P≤0.05有统计学意义。

2-3实验结果。

2-3-1CD3AK细胞鉴定：培养前外周血中CD3^-CD56⁺的CD3AK细胞为31.27％。收集培养7d的CD3AK细胞，用流式细胞仪检测其细胞表型，结果显示：CD3^-CD56⁺的CD3AK细胞高达81.19％，见图2和图3。

2-3-2各浓度三叶青水提取物TH-w4对CD3AK细胞生长影响：外周血单个核细胞PBMC经CD3AK细胞培养基培养7d后，CD3⁺CD8⁺T细胞的比例达到82.5％，提示细胞培养成功。CD3AK细胞经三叶青水提物处理48h后，细胞出现增殖，在0.15-2.44μg/ml浓度范围内增殖最明显，与对照组(0μg/ml)相比有显著性差异，结果见图4(*P<0.05，与0μg/ml组相比)。

可见，低浓度三叶青水提取物TH-w4能够显著促进人CD3AK细胞的增殖，故而上述实施例可作为三叶青提取物体外诱导扩增人CD3AK细胞的方法，且优选三叶青水提物Th-w4，浓度为0.15-2.44μg/ml。

实施例3：三叶青水提取物TH-w4对三种肿瘤细胞株的抑制作用。

3-1实验材料：无血清培养基购于浙江博纳生物科技有限公司；四甲基偶氮唑蓝(methlthiazolyl tetrazolium,MTT)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide DMSO)购于Sigma公司；淋巴细胞分离液取自于中国科学院血液病研究所；乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒购于日本世诺临床诊断制品株式会社；Encore自动生化分析仪购于北京希亚克技术有限公司；荧光倒置显微镜TE2000-S购于日本Nikon公司；流式细胞仪购于美国BD公司；流式细胞仪分析软件Cell Quest，每个标本分析细胞数≥l×10⁴。

3-2实验方法：取对数生长期的乳腺癌231、胃癌SGC-823和结肠癌SW-480细胞，分别配成3×10⁷/L的细胞悬液，并加入96孔板，每孔180μl，每组设5个复孔，同时设阴性对照组；将培养板放入37℃、50mL/L CO₂培养箱培养24h后，实验组分别加入浓度为0.16、0.65、2.5、10、39、156、624、2496μg/ml的三叶青水提物TH-w4，同时设不加药的对照组。于37℃、50mL/L CO₂培养箱中培养72h；在培养结束前4小时加入MTT 20μl/孔，继续培养4h后弃去上清，加入DMSO 150μl，使甲赞完全溶解，于酶标仪495nm处检测各孔吸光值(OD)记录结果。

并且，细胞抑制率IR(％)＝(对照OD值)—(实验OD值)/(对照OD)×100％。相同实验重复3次，取平均值。统计方法采用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料使用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，检验水准α＝0.05，P≤0.05有统计学意义。

3-3实验结果：将乳腺癌231、胃癌SGC-823和结肠癌SW-480细胞用三叶青水提物TH-w4进行诱导试验，经诱导72小时后，如图5所示，高浓度的三叶青水提物TH-w4对三种肿瘤细胞均有抑制作用，随着药物浓度的增加抑制越明显；但是，各浓度组对肿瘤细胞抑制深度均在156μg/ml以上，低于10μg/ml时各组均无抑制现象。

可见，高浓度三叶青提取物能抑制肿瘤细胞生长，但相同浓度三叶青提取物对人正常免疫细胞(包括αβT细胞、NK细胞和γδT细胞等)也有明显的抑制作用，说明三叶青提取物对肿瘤的抑制与药物细胞毒性相关，而非药物的活性诱导。

实施例4：三叶青水提物TH-w4对CD3AK细胞上穿孔素、CD107a和颗粒酶B的表达和杀伤活性的影响。

4-1实验材料：无血清培养基和CD3AK细胞培养基(浙江博纳生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑蓝(methlthiazolyl tetrazolium,MTT)和二甲基亚砜(dimethyl sμlfoxide DMSO)(Sigma公司)；淋巴细胞分离液(中国科学院血液病研究所)；IL-2、IL-15和IL-21(厦门特宝生物公司)；INF-γ购于Abender公司；胰蛋白酶、RPMl1640、小牛血清(GIBCO公司)；人AB血清(徐州市血站)；FITC和PE标记的CD3、FITC标记的γδTCR、PE标记的穿孔素(pore-forming protein，PFP)、颗粒酶B(Granzyme B，GrB)、APC标记的CD107a(联科生物有限公司)；乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒(日本世诺临床诊断制品株式会社)；垂直式电泳装置、电转移槽(北京希亚克技术有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)；ST-360酶标仪(上海科华实验系统有限公司)；Encore自动生化分析仪(北京希亚克技术有限公司；荧光倒置显微镜TE2000-S(日本Nikon公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；流式细胞仪分析软件Cell Quest，每个标本分析细胞数≥l×10⁴。

4-2实验方法。

4-2-1CD3AK细胞培养及鉴定：同实施例2中2-2-1的步骤。

4-2-2流式细胞仪检测CD3AK细胞上穿孔素(Perforin)、颗粒酶B(GranB)和CD107a的表达。

CD3AK细胞培养7d后，以每孔1×10⁶个/3mL接种至6孔板内，加入三叶青提取物(终浓度为0.04、0.15、0.61、2.44、9.77μg/ml)，于37℃、5％CO2培养箱中培养48h。收集细胞洗涤，测CD107a的管内加入FITC-CD8、PerCP-Cy5.5-CD3和APC-CD107a，避光孵育30min，PBS洗涤，弃上清，0.5ml PBS重悬细胞，上机检测。测GranB或Perforin的试管内，先加入FITC-CD8、PerCP-Cy5.5-CD3避光孵育30min，再加入固定液孵育15min，PBS洗涤，弃上清，加入破膜剂、PE-GranB或PE-Perforin，避光孵育15min，PBS洗涤一次，弃上清，0.5ml PBS重悬，上机检测。

4-2-3LDH释放法检测三叶青水提物TH-w4作用后的CD3AK细胞对三株肿瘤细胞的杀伤活性。

取经不同浓度(终浓度分别0.04、0.15、0.61、2.44、9.77μg/ml)三叶青水提物TH-w4诱导48h后的CD3AK细胞配成2×10⁹/L，作为效应细胞；对数生长期的乳腺癌231、胃癌SGC-823和结肠癌SW-480细胞分别配成2×10⁸/L，作为靶细胞；将效靶细胞各取0.5ml等量混合(效靶细胞比例＝10:1)，同时设置不加三叶青水提物TH-w4为对照组。置37℃、5％CO₂培养箱中孵育6h后，轻轻混匀，重悬细胞，1500r/min离心10min，收集上清液。LDH试剂盒按说明书要求操作，340nm波长下Encore自动生化分析仪测定LDH的活性单位(U/L)。每检测样本设3个复管，重复3遍，取平均值。

CD3AK细胞的杀伤活性＝(测定管LDH单位－效应细胞自然释放LDH管)/(靶细胞最大释放LDH管－靶细胞自然释放LDH管)×100％。统计方法采用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料使用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，检验水准α＝0.05，P≤0.05有统计学意义。

4-3实验结果。

4-3-1三叶青水提物TH-w4对Perforin、GranB、CD107a表达的影响。

将三叶青水提物作用于CD3AK后用流式细胞仪检测，发现三叶青水提物TH-w4对CD107a、Perforin影响不是很明显，而在0.15μg/ml浓度时对GranB具有明显的促进作用。结果见图6(*P<0.05)三叶青水提物TH-w4对CD3AK细胞GranB、Perforin、CD107a表达的影响，图7-1为同型对照，图7-2为空白对照组GranB表达，图7-3为三叶青水提物TH-w4浓度为0.15μg/ml组GranB表达。

4-3-2三叶青水提物TH-w4对三株肿瘤细胞诱导的CD3AK杀伤活性的影响。

实验结果显示：浓度为2.44-0.01μg/ml三叶青水提物TH-w4作用48h后的CD3AK细胞，对乳腺癌231、胃癌SGC-823和结肠癌SW-480细胞的杀伤活性显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。在0.125μg/ml时杀伤活性达最高(分别为66.4％、75.1％和79.7％)，与对照组(分别为38.4％、41.8％和41.2％)比较差异有统计学意义(P＜0.05)。三叶青水提物TH-w4浓度高于2.44μg/ml时，杀伤活性随浓度增高逐渐降低，当浓度为39μg/ml时，可抑制CD3AK细胞对3株肿瘤细胞的杀伤活性(P＜0.05)，结果见图8。

可见，低浓度三叶青水提物TH-w4能够促进CD3AK细胞穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达，明显提高CD3AK细胞的杀伤活性。

实施例5：三叶青水提物TH-w4对CD3AK细胞Bcl-2表达的影响。

5-1实验材料：三叶青块根(宁波市鄞州医药药材公司)；Anti-CD3、重组人白细胞介素-2(rhIL-2)(厦门特宝生物工程股份有限公司)；GAPDH、Bcl-2(Abcam.)；人AB型血浆(徐州市血站)。无血清培养基和CD3AK细胞培养基(浙江博纳生物科技有限公司)；Encore自动生化分析仪(北京希亚克技术有限公司)；荧光倒置显微镜TE2000-S(日本Nikon公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；流式细胞仪分析软件Cell Quest，每个标本分析细胞数≥l×10⁴。

5-2实验方法。

5-2-1CD3AK细胞培养及鉴定：同实施例2中2-2-1的步骤。

5-2-2Western Blot检测Bcl-2的表达。

收集培养7d后的CD3AK细胞，以每孔5×10⁵/3ml的细胞数加入6孔板内，加入三叶青水提物TH-w4(终浓度为0.04、0.15、0.61、2.44、9.77μg/ml)，同时设不加药的空白对照，继续培养48h。收集细胞并用1×PBS洗涤一次，用50μl细胞裂解液裂解胞提取蛋白，用BCA法测定蛋白样品浓度后用10％SDS-PAGE分离，转膜后，用5％脱脂奶粉室温封闭2h，一抗4℃封闭过夜，二抗37℃孵育2h。然后按照BCIP/NTP碱性磷酸酯酶显色试剂盒使用手册进行显色，显色结果用数码相机进行拍照记录。

5-3实验结果：经Western Blot检测，发现三叶青水提物TH-w4在0.15μg/ml浓度下对Bcl-2促进作用明显，结果见图9。

而Bcl-2是细胞凋亡研究中最受重视的基因之一，是一个抑制凋亡的基因，上述实验说明，低浓度三叶青水提物TH-w4能增加凋亡蛋白Bcl-2表达，从而提高CD3AK细胞的杀伤活性。

综上所述：1、高浓度三叶青水提物TH-w4能抑制肿瘤细胞生长，与药物细胞毒性相关，而非药物的活性诱导；2、低浓度三叶青水提物TH-w4能够显著促进人CD3AK细胞的增殖，并能够促进CD3AK细胞穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达，增加凋亡蛋白Bcl-2表达，明显提高CD3AK细胞的杀伤活性，故而三叶青提取物体具有制备杀伤肿瘤细胞药物的用途，且优选三叶青水提物Th-w4，浓度为0.15-2.44μg/ml。