一种水稻抗白背飞虱的新基因Wbph9(t)及其分子标记方法和应用与流程

本发明属于植物分子遗传学领域，涉及一种水稻抗白背飞虱的新基因Wbph9(t)及其分子标记和应用。

背景技术：

白背飞虱是水稻生产上的一种重要害虫，不仅直接危害水稻，还在取食过程中传播其他病害和病毒，严重威胁我国水稻的安全生产。发掘和鉴定新的抗虫基因，选育抗虫品种是最经济有效的防治手段。水稻抗白背飞虱基因的定位研究，仅有少数报道。McCouch等(1991)检测到与Wbph1共分离的RFLP标记RG146和RG445，但RG146和RG445是多拷贝标记，且未检测到其他多态性标记，Wbph1在哪条染色体上仍不清楚。刘志岩等(2001)将Wbph2定位于水稻第6染色体上，筛选到与该基因连锁的RFLP标记RZ667、RG264和RG64，它们与抗虫基因的遗传图距分别为25.6cM、36.4cM和27.8cM。Wbph6被定位到水稻第11条染色体的短臂上，与标记RM167的遗传距离为21.2cM(Li et al.,2004)。Yamasaki等(2003)将对于杀卵反应是必需的主效基因Ovc定位于第6条染色体短臂上，与标记RM1954连锁。Tan等(2004)从高抗白背飞虱的药用野生稻衍生系B5中鉴定了2个新的抗白背飞虱新基因Wbph7(t)和Wbph8(t)，这2个基因分别定位于第3条染色体R1925-G1318之间1.1cM区域和第4条染色体R288-S1118之间0.3cM区域，分别与在该材料上鉴定的2个抗褐飞虱基因Bph14和Bph15位于同一区间。

白背飞虱抗性除受主效基因控制外，在某些水稻品种中还含有微效基因控制的抗性。具有微效基因的品种通过其对主效基因的修饰，在抗虫性中起着重要作用。国内外科学家在不同水稻品种中已检测到一些抗白背飞虱QTL位点。Kadirvel等(1999)比较IR64/Azueena的DH群体在白背飞虱侵染和不侵染情况下幼苗期叶片和根干重的差异，发现在第11条染色体RG103-RG167上有显著的抗性QTL。在对该群体进一步的深入发掘发现(Geethanjali et al.,2009)，1个显著抗白背飞虱的QTL位于第7条染色体RG511和RG477之间，另外还检测到3个与白背飞虱抗性显著相关的区域，分别位于第1条染色体W1和pMRF1之间、第2条染色体XLRfrI7和RG157之间以及第7条染色体RG711和CDO418之间。Kadirvel等(2003)从Basmati370和ASD16杂交后代中定位了6个抗白背飞虱的QTL位点，有3个在第7条染色体上，另外3个分别在第3、5和12条染色体上。Sogawa等(2001)利用一个双单倍体(Doubled-haploid，DH)群体定位了2个与杀卵反应有关的QTL，一个位于第6条染色体上的RFLP标记CT201和RZ450之间，另一个位于第11条染色体标记RG167与CT442之间。

Yamasaki等(2003)通过近等基因系(Near-isogenic lines，NILs)，重复检测到位于第6条染色体对白背飞虱卵具有强作用力的主效基因Ovc，另外又检测到4个QTL，分别位于第1、4、5、5条染色体上。

寒川一成等(2003b)应用窄叶青/京系17的DH群体检测到1个影响蜜露分泌的微效QTL，10个与杀卵作用相关QTL，其中2个杀卵主效QTL qOVC-6a和qOVC-6b分别位于第6条染色体短臂上相邻的CT201-RZ450和CT115-CT506区间，其贡献度分别为25.7％和29.6％。寒川一成等(2003a)发现粳稻品种春江06对白背飞虱同时具有拒食抗性和杀卵抗性，分析春江6号和感虫品种TN1的DH群体，检测到4个与迁入密度相关的QTL(qIMG)，分别位于第2、3、4和11条染色体上；5个影响蜜露分泌的QTL(qHND)，分别位于第2、3和4条染色体；4个与虫卵堆积相关的QTL(qEGN)，分别位于第2、3和4条染色体上。在这些QTL中，qIMG-4、qHND-4和qEGN-4的贡献度分别为78.4％、71.7％和58.7％，都定位于春江06第4条染色体RM401-RM335区域，可能指向了同一个抗性基因(Sogawa et al.,2005)。进一步精细定位将2个主效QTL qSI-4和qOVI-6分别定位在水稻第4和第6条染色体上，这分别解释了春江06的70％和60％以上的拒食抗性和杀卵抗性(Sogawa et al.,2009)。Chen等(2010)利用东乡野生稻与栽培稻构建的一个染色体片段代换系(Chromosome segment substitution lines，CSSLs)检测到3个抗白背飞虱的QTL，分别是：qWbph2位于第2条染色体RM1285和RM555之间，qWbph5位于第5条染色体RM3870和RZ70之间，qWbph9位于第9条染色体RG451和RM245之间，其中qWbph9表现最稳定，且贡献率最大，已适合进行分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)育种。

在前期研究中，我们利用小粒野生稻与栽培稻IR24杂交、回交，结合胚拯救和分子标记辅助选择技术，构建了一套小粒野生稻导入系，通过抗白背飞虱鉴定，筛选获得了高抗白背飞虱且农艺性状稳定的水稻品系K41。为了挖掘K41中的抗性基因及其紧密连锁的分子标记，本发明分别以感虫品种桂1025为母本，以抗虫品系K41为父本杂交，得到的F₁再自交，从而构建了F₂分离群体，每个F₂单株通过自交获得相应的F_2:3家系，300个F₂单株采用单粒传法，通过连续自交获得重组自交系群体(RILs，F₇)。用亲本间有多态性的SSR标记分析F₂单株的基因型，同时结合相应的F₃家系的的平均抗虫级别进行QTL定位。结果表明在第6号染色体长臂RM340和RM5604间存在一个主效的QTL位点，LOD值为20.5，抗性贡献率为33.6％，暂命名为Wbph9(t)。为了寻找与Wbph9(t)连锁更精密的标记，用RM340和RM5604筛选了6000个F₃单株。进一步利用这些多态性引物检测筛选获得了52个重组单株的基因型，结合其抗性鉴定结果，最后将Wbph9(t)定位于MG11和MG32之间，并与标记MG21精密连锁，参考日本晴基因组序列可知，MG11和MG32之间的物理距离约120kb。

在将该抗性基因杂交转育到其它材料后，利用分子标记MG21检测抗性基因存在的准确率均达到98％以上，因此，利用两者之间的分子标记MG21来鉴定Wbph9(t)的存在具有非常高的效率，这样也大大提高了抗白背飞虱水稻品种的育种进度。

技术实现要素：

本发明针对上述研究背景，利用高抗白背飞虱的品种K41与髙感白背飞虱的品种桂1025杂交获得的F_2:3家系群体及重组自交系群体，通过抗性鉴定和遗传分析，精细定位了水稻第6号染色体上的一个水稻抗白背飞虱基因Wbph9(t)，获得与之紧密连锁的基于PCR扩增的实用经济型分子标记。该标记可以预测水稻材料是否对白背飞虱具有抗性，提高抗白背飞虱水稻品种的选择效率。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种水稻抗白背飞虱基因Wbph9(t)，在水稻基因组第6号染色体28,200,000-28,700,000bp的区间内存在一个与水稻抗白背飞虱相关的基因位点，抗虫品种K41在该位点上的等位基因能显著提高水稻材料对白背飞虱的抗性。

本发明还提供了一种上述水稻抗白背飞虱基因Wbph9(t)紧密连锁的分子标记，所述的水稻抗白背飞虱基因Wbph9(t)的分子标记为MG11、MG21和MG32。

作为优选，分子标记MG11是由下列引物对经PCR扩增获得：GM11的引物对的上游引物为Seq ID No.1所示的序列，引物对的下游引物为Seq ID No.2所示的序列。

作为优选，分子标记MG21是由下列引物对经PCR扩增获得：GM21的引物对的上游引物为Seq ID No.3所示的序列，引物对的下游引物为Seq ID No.4所示的序列。

作为优选，分子标记MG32是由下列引物对经PCR扩增获得：GM32的引物对的上游引物为Seq ID No.5所示的序列，引物对的下游引物为Seq ID No.6所示的序列。

本发明还提供了所述的水稻抗白背飞虱基因Wbph9(t)或所述的分子标记在水稻育种中的应用。

本发明还提供了所述的水稻抗白背飞虱新基因Wbph9(t)的供体材料K41或供体材料K41携带抗白背飞虱新基因Wbph9(t)的衍生材料及其它具有抗白背飞虱基因Wbph9(t)的材料。

本发明还提供了所述的水稻抗白背飞虱新基因Wbph9(t)的受体材料，包括稻属所有材料，即栽培稻和野生稻。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

(1)本发明鉴定到第6号染色体上的抗白背飞虱新基因Wbph9(t)及可以对其进行基因型鉴定的共显性分子标记，与目前报道的影响粒重的基因Wbph1、Wbph2、Wbph3、Wbph4、Wbph5、Wbph6、Wbph7(t)、Wbph8(t)、Ovc、qSI-4、qOVI-6、qWbph2、qWbph5和qWbph9都不同，Wbph9(t)是源于小粒野生稻基因渗入系K41的一个抗白背飞虱的新基因位点。

(2)本发明通过对水稻抗白背飞虱新基因Wbph9(t)分子标记的筛选，能够获得对白背飞虱抗性水平显著提高水稻新品种。

(3)本发明的水稻抗白背飞虱新基因Wbph9(t)分子标记可用于苗期育种群体的基因型选择，有效的鉴别抗白背飞虱的个体，便于及时杂交选育，加快育种进程。

附图说明

图1为水稻品系K41携带的抗白背飞虱主效基因Wbph9(t)在第6号染色体长臂上与分子标记MG21的紧密连锁关系(其中：A-Wbph9(t)的初步定位；垂直线表示第6号染色体；水平短线表示染色体上的分子标记；括号内的数值表示标记间的物理距离(Mb)；B-Wbph9(t)的精细定位；Wbph9(t)定位于MG11和MG32之间120kb的区间，分子标记MG21与抗性基因紧密连锁。n表示筛选的F₃重组单株总数)；

图2为分子标记MG21在不同水稻材料中扩增产物的电泳检测带型；其中：1-Marker；2-K41；3-桂1025；4-35为K41和桂1025杂交育种后代单株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

以下实施例中使用的试剂、试剂盒和仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如果没有作特别说明的，与常规使用的方法一致。

实施例1：分子标记的获得

(一)桂1025/K41 F₂家系群体和RILs的构建及表型鉴定

1、在前期研究中，我们利用小粒野生稻与栽培稻IR24杂交、回交，结合胚拯救和分子标记辅助选择技术，构建了一套小粒野生稻导入系，通过抗白背飞虱鉴定，筛选获得了高抗白背飞虱且农艺性状稳定的水稻品系K41。为了挖掘K41中的抗性基因及其紧密连锁的分子标记，本发明分别以感虫品种桂1025为母本，以抗虫品系K41为父本杂交，得到的F₁再自交，从而构建了F₂分离群体，每个F₂单株通过自交获得相应的F_2:3家系，300个F₂单株采用单粒传法，通过连续自交获得重组自交系群体(RILs，F₇)。

2、采用苗期接虫处理，对亲本、F_2:3家系和RILs进行抗虫鉴定。为确保亲本、F_2:3家系和RILs中每个材料生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。每个材料各50粒种子播于一个长45cm，宽35cm，高8cm，且盛有5cm厚营养土的铁质托盘中。每个盘每个材料播2个重复，其中随机播种亲本和TN1(感虫对照)各2个重复。播种7天后间苗，淘汰病弱苗。待苗长到两叶一芯期时，按8头/苗的比例接种2-3龄白背飞虱若虫，最后罩上尼龙纱网。当感虫对照TN1全部死亡时，参照寒川一成等(2003b)的方法对每个单株进行0、1、3、5、7或9级的抗性评价(参见表1)，对每份材料通过加权平均计算该材料的抗性级别，上述抗虫鉴定重复两次，取平均值作为该材料的抗性级别，并推测其基因型。

表1水稻苗期抗白背飞虱鉴定的分级标准

(二)桂1025/K41F₂群体的分子标记分析

1、利用CTAB法(Murray and Thompsom,1980)提取亲本及F₂群体各单株的叶片基因组DNA。

2、根据Gramene网站(http://www.gramene.org/)公布的SSR标记按照较均匀的遗传距离选择一定数目的分子标记。另外，基于该基因最后的定位区段，参考水稻品种日本晴相应的基因组序列，利用SSR搜索工具SSRIT (http://www.gramene.org/db/marker/ssrtool)来寻找SSR基序，并根据其侧翼序列设计引物，为备选标记。其中，SSIT设置参数为：最小基序长度为3聚体，最小重复数为5，搜素所有的SSR基序。选择所有大于15碱基(基序长度×重复数)的SSR基序，最后基于该基因最后定位区段，比较该区段在水稻品系9311及日本晴相应的基因组序列，在两者具有差异的区段设计STS标记用于精细定位。

3、DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳

参考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，对个单株分别提取基因组DNA。

PCR扩增体系采用10μL的反应体系，模板DNA 10ng，正向、反向引物各0.8μmol，10×PCR缓冲液1μL，dNTPs 0.2mmol，Taq DNA聚合酶0.25U，用ddH2O补齐至10μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃50s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物在6％聚丙烯酰胺变性凝胶和银染显色法进行检测，或采取本领域已知的常规检测技术。

4、根据F₂单株的抗虫级别，分别选择15个极端抗虫单株和15个极端感虫单株的叶片基因组DNA混合构建抗、感池。利用在亲本间有多态性的引物分别筛选抗感DNA池，获得有多态性的分子标记，该类多态性标记很可能与抗性基因是连锁的。然后，选择连锁标记所在染色体上在亲本间有多态性引物筛选F₂分离群体的各个单株，获得群体基因型数据。根据连锁交换规律，通过软件JoinMap 3.0，利用群体基因型数据构建水稻部分遗传图谱，并获得各分子标记的遗传距离。最后，结合F₂群体各个单株的基因型数据和相应的白背飞虱抗性鉴定的抗虫级别，利用软件NetWork QTL 3.0对目标染色体进行QTL位点扫描。

(三)利用分子标记筛选桂1025/K41和Lemont/K41的F₃重组单株精细定位Wbph9(t)

根据QTL的定位结果，利用初步定位两侧的SSR标记RM340和RM5604筛选F₃单株，获得在两标记间发生重组的单株。同时在初步定位区段内筛选更多在亲本间具有多态性的引物，结合重组单株的基因型和表型，考察标记与抗虫表型共分离的情况。

(四)结果与分析

苗期集团法接虫鉴定结果表明：K41和桂1025的平均抗虫级别分别为2.9和9.0，说明K41高抗白背飞虱而桂1025高感白背飞虱。190个F_2：3家系对白背飞虱的平均抗虫级别的频率分布呈连续分布，最小值为1.8，最大值为9.0。重组单株的基因型和相应家系的平均抗虫级别见图2。

用亲本间有多态性的SSR标记分析F₂单株的基因型，同时结合相应的F₃家系的的平均抗虫级别进行QTL定位。结果表明在第6号染色体长臂RM340和RM5604间存在一个主效的QTL位点，LOD值为20.5，抗性贡献率为33.6％。

分子标记RM340和RM5604在测序的粳稻品种日本晴基因组序列中的物理距离约0.5Mb，为了寻找与Wbph9(t)连锁更精密的分子标记，本发明用RM340和RM5604筛选了6000个F₃单株。同时在初步定位区段内筛选更多在亲本间具有多态性的引物。进一步利用这些多态性引物检测筛选获得了52个重组单株的基因型，结合其抗性鉴定结果，最后将Wbph9(t)定位于MG11和MG32之间，并与标记MG21精密连锁(图1)，参考日本晴基因组序列可知，MG11和MG32之间的物理距离约120kb。在将该抗性基因杂交转育到其它材料后，利用分子标记GM21检测抗性基因存在的准确率均达到98％以上(图2)，因此，利用两者之间的分子标记GM21来鉴定Wbph9(t)的存在具有非常高的效率，这样也大大提高了抗白背飞虱水稻品种的育种进度。

实施例2：分子标记的验证

(一)材料与方法

阴性品种：30份，感虫品系桂1025、Lemont、TN1均为本实验室保存的常规水稻材料，桂1025/K41杂交组合后代中感虫家系27份。

阳性品种：30份，抗虫品系K41、桂1025/K41杂交组合后代中抗虫家系29份。

GM21的引物对的上游引物为Seq ID No.3所示的序列，引物对的下游引物为Seq ID No.4所示的序列；

Seq ID No.3：AAAGAGATTTATAATCCAAATTTTGGCCA；

Seq ID No.4：GCCAAAGTAATTTAGGCCTGA。

DNA提取方法和分子标记的分析方法同实施例1。

(二)结果

用上述方法，分别对水稻品系K41、桂1025、Lemont、TN1等60份不同样本的基因组DNA进行PCR扩增。

结果表明，在阳性样本中均能扩增出相应的片段，而在阴性样本中均不能扩增出这些片段。由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有抗白背飞虱主效基因的样本，从而显著提高抗白背飞虱水稻材料的选择效率。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所

<120> 一种水稻抗白背飞虱基因Wbph9（t）及其分子标记和应用

<130> ZYWS

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcagtcatc aattttatac cagcgagct 29

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 21

<212> DNA

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