一种乳酸菌发酵溶胞产物、制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种乳酸菌发酵溶胞产物、制备方法及其应用。
背景技术：
：目前全球工业化和城市化对环保的影响很大，各国人民普遍关注污染问题。表现在美容护肤品上，就是人们寻找具有高科技含量、有益肌肤健康又不受化学品污染的生物技术护肤品。另外，随着人们安全意识的提高，为避免对皮肤的不良影响，人们更倾向于选择安全性高的皮肤护理产品。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种能有效促进皮肤更新、减少黑色素合成、具有美白功效、能有效清除自由基、改善真皮组织生理功能，具有抗衰功效、且安全性较高的乳酸菌发酵溶胞产物、制备方法及其应用。本发明第一方面提供一种乳酸菌发酵溶胞产物，其有效成分为：乳酸菌菌种于种子培养基中扩培后，于发酵培养基中发酵而得的初始体系，经离心、乳化和灭活处理后，得到的溶胞产物。进一步的，所述乳酸菌包括乳杆菌中的一种或多种、以及双歧杆菌中的一种或多种。应当说明的是，由于乳杆菌和双歧杆菌的培养条件有一定差别，优选的，乳杆菌采取兼性厌氧培养，双歧杆菌采取厌氧培养，因而，乳杆菌和双歧杆菌优选的分别扩培、发酵并离心后，再混合乳化灭菌处理。进一步的，所述乳杆菌包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌；所述双歧杆菌包括乳双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌。进一步的，所述种子培养基包括如下比例的各组分：葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、酵母膏5g、无水乙酸钠5g、吐温-801ml、柠檬酸氢二铵2g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.58g、一水硫酸锰0.19g、加水至1000ml。进一步的，所述发酵培养基以质量分数计包括：葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉浸粉0.5％、酵母膏1％、无水乙酸钠0.5％、吐温-800.1％、柠檬酸氢二铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、七水硫酸镁0.058％、一水硫酸锰0.019％、L-半胱氨酸盐酸盐0.1％。本发明第二方面提供一种乳酸菌发酵溶胞产物的制备方法，包括以下步骤：S1、将乳酸菌菌种分别于种子培养基中扩培，所述乳酸菌包括乳杆菌中的一种或多种、以及双歧杆菌中的一种或多种；S2、将扩培的乳杆菌和双歧杆菌种子分别接种至发酵培养基中发酵，得到发酵液；S3、将发酵液离心处理，得到菌泥；S4、根据菌泥质量添加保护剂，高速搅拌以充分乳化，得到乳化液；S5、将乳化液高温灭菌，得到乳酸菌发酵溶胞产物。进一步的，步骤S1中，乳酸菌菌种以占比种子培养基1％-10％的接种量接种于种子培养基中，接种温度为35-45℃，种子成熟OD为2.0-5.0，pH<5.0，乳杆菌采取兼性厌氧培养，双歧杆菌采取厌氧培养。进一步的，步骤S2中，将步骤S1扩培后的种子，按照占比发酵培养基1％-10％的接种量接种于发酵培养基中，发酵温度37℃，控制起始pH6.0-7.0、发酵pH4.5-6.0、搅拌转速60-100r/min、发酵时间7-10h、放罐OD7-10。进一步的，步骤S3中，控制发酵液离心转数为5000-10000r/min，离心半径为6-12cm，离心时间为15-30min，离心后倒掉上清液得到菌泥。进一步的，步骤S4中，将乳杆菌和双歧杆菌菌泥进行混合，混合比例1:1-1:10，根据混合菌泥质量，按照1:1-1:10添加保护剂，经高速搅拌器进行充分乳化。进一步的，步骤S5中，乳化液高温湿热灭菌温度95-121℃，灭菌时间15-30min。本发明第二方面提供一种乳酸菌发酵溶胞产物，在化妆品中的应用。应当说明的是，所述化妆品应包括但不限于乳液、唇、唇彩、化妆水、面膜、面霜、精华露、软膏、摩丝、贴剂、发蜡、溶液、喷雾剂、蜡基棒状物或湿纸巾；尤其是在面霜、精华露中的应用。借由上述方案，本发明至少具有以下优点：乳酸菌发酵溶胞产物是乳酸菌菌体与保护剂进行乳化灭菌而得到的，该2种原料都是可食用的，且在整个制备过程中，发酵温度和发酵pH温和，且不添加任何有机试剂，确保产品对人体的安全。乳酸菌发酵溶胞产物富含功能性大分子肽聚糖、酯磷壁酸、益生菌源脱氧核糖核酸(DNA)等成分，能有效促进皮肤更新、减少黑色素合成，具有美白功效。另外，其还富含益生菌的超氧化物歧化酶、细菌素、益生菌源活性肽，能有效清除自由基、改善真皮组织生理功能，具有抗衰功效，从而对皮肤具有较强的美白、抗衰功能。上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。附图说明图1是本发明中GC-MS分析乳酸菌发酵溶胞产物结果图；图2是本发明中乳酸菌发酵溶胞产物对DPPH自由基清除作用曲线图；图3是本发明中乳酸菌发酵溶胞产物的抑制酪氨酸酶活性示意图；图4是本发明中乳酸菌发酵溶胞产物对色斑数量改善结果图；图5是本发明中乳酸菌发酵溶胞产物对面部黑色素数值降低程度结果图；图6是本发明中乳酸菌发酵溶胞产物对皱纹数量减少程度结果图；图7是本发明中乳酸菌发酵溶胞产物对皮肤平滑度改善程度结果图。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1乳酸菌发酵溶胞产物制备本实施例提供一种乳酸菌发酵溶胞产物的制备方法，包括以下步骤：S1、将乳酸菌菌种分别于种子培养基中扩培，所述乳酸菌包括乳杆菌中的一种或多种、以及双歧杆菌中的一种或多种；其中，种子培养基：葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、酵母膏5g、无水乙酸钠5g、吐温-801ml、柠檬酸氢二铵2g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.58g、一水硫酸锰0.19g、加水至1000ml，调pH至6.8，灭菌118℃，20min；S2、将扩培的乳杆菌和双歧杆菌种子分别接种至发酵培养基中发酵，得到发酵液；发酵温度：37℃、控制起始pH:6.8、发酵pH:5.5搅拌转速：80r/min；其中，发酵培养基：葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉浸粉0.5％、酵母膏1％、无水乙酸钠0.5％、吐温-800.1％、柠檬酸氢二铵0.2％、磷酸氢二钾0.2％、七水硫酸镁0.058％、一水硫酸锰0.019％、L-半胱氨酸盐酸盐0.1％。发酵时间：8.5h，放罐OD：9.5；S3、将发酵液离心处理，离心转速6500r/min，时间15min，倾倒上清液收集菌泥；S4、将乳杆菌和双歧杆菌菌泥进行混合，混合比例1:1-1:10，根据混合菌泥质量，按照1:1-1:10添加保护剂，保护剂成分：5-50％海藻糖，优选28％海藻糖，经高速搅拌器进行充分乳化，得到乳化液；S5、将乳化液高温湿热灭菌，温度95-121℃，灭菌时间15-30min，得到乳酸菌发酵溶胞产物。实施例2乳酸菌发酵溶胞产物在化妆品中的应用一、乳酸菌发酵溶胞产物的性质实施例1制备所得的乳酸菌发酵溶胞产物，外观为澄清液体、颜色为透明至淡黄色，pH值5.0-6.0，可溶性固含物含量15-25％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，因此，该发酵提取物符合化妆品质量要求。采用高效液相色谱(HLPC)技术,研究了乳酸菌发酵溶胞产物的相关成分，具体数据如下：苹果酸：0.32g/100mL，乳酸：1.90g/100mL，乙酸：2.99g/100mL。维生素含量：维生素B1：0.013mg/100g，维生素B2：0.285mg/100g，维生素B6：0.0211mg/ml，维生素C：0.0134mg/ml。氨基酸含量：苏氨酸：0.019g/100g，谷氨酸：0.103g/100g，组氨酸：0.048g/100g，天冬氨酸：0.025g/100g，胱氨酸：0.026g/100g，异亮氨酸：0.004g/100g，酪氨酸：0.029g/100g。用GC-MS分析乳酸菌发酵溶胞产物的化学成分，具体如表1和图1所示：表1GC-MS分析乳酸菌发酵溶胞产物的化学成分表二、乳酸菌发酵溶胞产物的安全性检测人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例1获得的乳酸菌发酵溶胞产物进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。1、试验对象选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。2、试验方法称取0.020g-0.025g固体样品或半固体的样品放入斑试器中备用。将液体样品0.2mL到0.025mL滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油。试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。3、试验结果斑贴试验结果如表2所示："-"＝阴性反应；"±"＝可疑反应：仅有微弱红斑；"+"＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；"++"＝强阳性反应(疱疹反应)；红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹；反应可超出受试区；"+++"＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)；明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹；反应超出受试区。根据化妆品卫生规范2007，人体斑贴试验判断标准为：30例受试者中出现1级皮肤不良反应的人数多于5例，或二级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例三级或三级以上皮肤不良反应时，则判定受试物对人体有不良反应，反之，则视为对人体无不良反应。从表2中可以看出：实施例1得到的乳酸菌发酵溶胞产物未产生可疑反应，说明本发明提供的乳酸菌发酵溶胞产物均具有安全性，不会给人体带来不良反应。表2乳酸菌发酵溶胞产物的斑贴试验结果三、乳酸菌发酵溶胞产物的抗氧化性能检测DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：以实施例1所得乳酸菌发酵溶胞产物作为待测物；(1)取等体积(一般为3mL)的待测物与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A1管)；(2)取等体积的无水乙醇(待测物溶剂)与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A2管)；(3)取等体积的无水乙醇与待测物混匀(A3管)；(4)反应30min后，在517nm下测A1、A2、A3管吸光度值。清除率计算公式为：清除率(％)＝[(A2+A3)-A1]/A2做出乳酸菌发酵溶胞产物对DPPH自由基清除作用曲线，见图2。由图可知，实施例1所得乳酸菌发酵溶胞产物对DPPH清除作用的IC50＝8.6％，说明乳酸菌发酵溶胞产物具有较强的抗氧化能力，可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，发挥其抗衰老的作用。三、乳酸菌发酵溶胞产物的美白功效分析酪氨酸酶是黑素生成的关键酶，它控制着黑素的形成过程,其活性程度对色素的沉积起主要作用。目前市场上销售的许多美白、祛斑产品都是以抑制酪氨酸酶达到美白作用,故对酪氨酸酶抑制作用的强弱是评价增白化妆品的主要指标。通过测定样品对酪氨酸酶的影响来评价样品的美白功能，具体方法如下：按表3配置溶液：表3、溶液配制列表单位(mL)C1C2T1T2L-酪氨酸2222样品0022PBS4523酪氨酸酶1010总体积7777注：C1和T1加入1mL酪氨酸酶，酶活为100U/mL；样品为实施例1所得乳酸菌发酵溶胞产物；(1)C2管配好摇匀后，在37℃水浴锅中水浴加热10min，波长475nm下调零。(2)C1管溶液配好摇匀，37℃水浴10min后，加酪氨酸酶1ml，继续水浴10分钟，测定C1吸光度值。(3)按(1)(2)同样方法，以T2调零测定T1吸光度值。(4)计算样品对酪氨酸酶的活性抑制率T(％)：T(％)＝(C1-T1)/C1×100％实验证明，本发明实施例1所得10％乳酸菌发酵溶胞产物对酪氨酸酶活性的抑制率为38.46％，1％的熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制率98.12％，如图3所示，即本发明提供的10％乳酸菌发酵溶胞产物的美白效果相当于0.392％的熊果苷的效果，具有一定的美白功效。四、乳酸菌发酵溶胞产物化妆品人体测试方法：分别各选20名年龄在28-50岁之间的女性志愿者使用含10％、20％乳酸菌发酵溶胞产物的面膜，以不含乳酸菌发酵溶胞产物的基质配方作为空白对照，每天晚上使用1次。使用VISIA全脸分析仪拍照分析，使用MPA580皮肤测试仪分析黑色素数值。结果：乳酸菌发酵溶胞产物可显著降低皮肤色斑数量，提亮肤色，减轻皱纹数量和程度，提高平滑度，使肌肤年轻化。1.祛斑与亮肤效果如图4所示，乳酸菌发酵溶胞产物使用4周色斑数量已有显著改善，如图5所示，使用6周后皮肤黑色素数值有显著下降。2.抚平皱纹效果如图6所示，乳酸菌发酵溶胞产物具有显著的促进皮肤年轻化效果，使用4周后，不同浓度处理组皱纹数量均有极显著降低。3.改善皮肤平滑度如图7所示，乳酸菌发酵溶胞产物可快速改善皮肤平滑度，使用2周后有显著改善。以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3