一种用于结核杆菌链霉素耐药快速检测引物及其试剂盒的制作方法
本发明涉及一种生物检测试剂的研发，尤其是一种用于结核杆菌链霉素耐药快速检测引物及其试剂盒，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
链霉素(Streptomycin，SM)是第一个发现与核糖体相互作用的抗生素。1944年，Selman Waksman发现SM可用于治疗结核病。早在1946年，就已经有关于结核杆菌对SM产生耐药性的报道。2000年第4次全国结核病流行病学调查显示，初治病人中使用SM者占88.1％，我国结核杆菌SM耐药率为17.3％；2010年第5次全国结核病流行病学调查发现，结核杆菌SM耐药率为19.6％，结核杆菌对SM的耐药率呈上升趋势，仅次于异烟肼(isoniazid，INH)耐药，应当引起人们的高度关注。
因此，一种快速检测结核杆菌链霉素耐药的引物及试剂盒被提出。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于结核杆菌链霉素耐药快速检测引物及其试剂盒。
本发明的目的是提供一种用于结核杆菌链霉素耐药快速检测引物，所述引物包括如下引物的至少一组：
RpslForward：5’—CCAACCATCCAGCAGCTGGT—3’
RpslReverse：5’—ATCCAGCGAACCGCGGATGA—3’
rrsForward1：5’—ACCGGCCAACTACGTGC—3’
rrsReverse1：5’—CGACAAACCACCTACGAGC—3’
rrsForward2：5’—GTGTGGGTTTCCTTCCTTGG—3’
rrsReverse2：5’—TTAATCCACATGCTCCGCC—3’
rrsForward3：5’—AGCAACGCTGCGGTGAATAC—3’
rrsReverse3：5’—TCCCGAGGGTTAGGCCACT—3’。
一种用于结核杆菌链霉素耐药快速检测的试剂盒，其特征在于：至少包括引物
RpslForward：5’—CCAACCATCCAGCAGCTGGT—3’
RpslReverse：5’—ATCCAGCGAACCGCGGATGA—3’
或者包括引物：
rrsForward1：5’—ACCGGCCAACTACGTGC—3’
rrsReverse1：5’—CGACAAACCACCTACGAGC—3’
或者包括引物：
rrsForward2：5’—GTGTGGGTTTCCTTCCTTGG—3’
rrsReverse2：5’—TTAATCCACATGCTCCGCC—3’
或者包括引物：
rrsForward3：5’—AGCAACGCTGCGGTGAATAC—3’
rrsReverse3：5’—TCCCGAGGGTTAGGCCACT—3’
表1.比例法与高分辨率熔解曲线检测结核杆菌链霉素耐药性的比较
本发明还涉及使用上述用于结核杆菌利福平耐药性快速检测引物组制成的试剂盒，采用高分辨率熔解曲线(HRM)技术，建立了快速检测结核杆菌链霉素耐药的方法。
目前普遍认为结核杆菌耐药机制包括细胞壁通透性的改变、泵蛋白的调控、酶失活、靶基因的突变等因素，其中引起结核杆菌耐药的主要原因之一是基因突变。分子流行病学调查研究结果显示，约80％的耐链霉素结核杆菌临床分离株可见RpsL和rrs基因突变。其中约52％～59％的SM耐药菌株RpsL基因发生突变，突变位点主要集中在第43位和第88位氨基酸，二者密码子均由AAG突变为AGG，氨基酸由赖氨酸(L ys)突变为精氨酸(A rg)。还有8％～21％的SM耐药菌株rrs基因发生突变，突变主要集中在530环区和904位碱基。由此可见，Rpsl基因和rrs基因的突变与结核杆菌链霉素耐药性有密切关系，因此，可通过分析这两个基因的突变检测大部分结核杆菌对链霉素的耐药性。
本发明根据结核杆菌链霉素(SM)耐药相关基因Rpsl和rrs的常见突变区的DNA序列，设计检测突变的引物，用高分辨率熔解曲线(high-resolution melting curve，HRM)分析方法对49株结核杆菌分离株进行菌株的链霉素耐药性的快速检测，以传统的比例法药物敏感性试验检测结果为标准，评价高分辨率熔解曲线法检测链霉素耐药性的敏感性、特异性，建立一种快速检测链霉素耐药性的方法，为耐药结核病的快速辅助诊断提供技术支持。
与现有技术相比，本发明具有检测时间短，一般不超过3天，准确率高，操作简单，费用低，易推广等特点。
附图说明
图1是链霉素耐药相关基因Rpsl的HRM检测分析结果。
图2是链霉素耐药相关基因rrs的HRM检测。
具体实施方式
实施例1：实验方案如下：
(1)用接种环刮取在改良罗氏培养基上生长良好的菌，放入装有TEbuffer的EP管中，85℃金属浴灭活45min。
(2)按照柱式分枝杆菌DNAout试剂盒的说明书提取各种菌株的DNA。
(3)测DNA浓度，按照不同的浓度稀释到10ug/ml。
反应体系：总体积10ul(HRM Mix：5ul；MgCl2：1.2ul；H2O：2.3ul；分别使用以下上下游引物各：0.5ul；DNA模板：1ul)；上下游引物为：
RpslForward：5’—CCAACCATCCAGCAGCTGGT—3’
RpslReverse：5’—ATCCAGCGAACCGCGGATGA—3’
rrsForward1：5’—ACCGGCCAACTACGTGC—3’
rrsReverse1：5’—CGACAAACCACCTACGAGC—3’
rrsForward2：5’—GTGTGGGTTTCCTTCCTTGG—3’
rrsReverse2：5’—TTAATCCACATGCTCCGCC—3’
rrsForward3：5’—AGCAACGCTGCGGTGAATAC—3’
rrsReverse3：5’—TCCCGAGGGTTAGGCCACT—3’；
反应参数：预变性95℃10min；变性95℃10s；退火60℃15s；sec target 53℃；延伸72℃10s，共50个循环；95℃1min；40℃1min；70℃1s；95℃continuous；40℃30s；。
2实验结果
2.1结果判断：
(1)每个样品设置3个重复。
(2)进行HRM分析时，试验孔对应的Cp＜30。如果Cp值大于30，则要稀释样品，重新进行试验，直至样品的Cp值小于30且复孔Cp值的变化控制在0.5之内以减小试验误差。
(3)若是样品3个复孔的峰形相同但与野生型不同，则判断为突变株，反之则为野生株。若有2个复孔的结果与野生型不同，则判断为突变型。若样品3个复孔的峰形均不同，则要重复试验以确定。
2.2 HRM结果：
使用结核杆菌链霉素耐药株16株，用本方法检测到突变阳性的为13株。使用敏感株33株，用本方法检测到突变阴性的为28株。本方法的敏感性为81.25％；特异性81.82％。采用本组引物，用高分辨率熔解曲线(HRM)技术进行药敏检测，获得药敏信息所需时间不超过3天。
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