秃疮花提取物及其提取方法与应用与流程

本发明涉及植物源抗植物病原菌的药物，具体涉及一种秃疮花提取物及其提取方法与应用。

背景技术：

植物病原菌对植物的健康生长和发育、农作物的产量和质量具有非常严重的影响。因此，植物杀菌剂的应用在现代农业中具有重要的意义。但是，同一种杀菌剂的长期重复使用已经导致植物病原菌对很多现行植物杀菌剂产生了很强的耐药性。此外，很多国家已经禁止使用一些对环境、人或生态具有不良影响的农用杀菌剂。因此，研究和开发高效低毒且环保的新型植物杀菌剂具有重要的意义。

生物农药是当今新农药研究最热门的领域，而植物源农药是生物农药的一个重要方面。秃疮花（Dicranostigma leptopodum (maxim.）fedde）又名秃子花、勒马回（陕西），兔子花等，属于罂粟科（Papaveraceae）秃疮花属植物之一。该植物广泛分布于云南西北部、四川西部、西藏南部、青海东部、甘肃南部至东南部、陕西秦岭北坡、山西南部、河北西南部和河南西北部，生于海拔400-2900（-3700）米的草坡或路旁，田埂、墙头、屋顶也常见。其根或全草可作药用，有清热解毒、消肿镇痛、杀虫等功效，治风火牙痛、咽喉痛、扁桃体炎、淋巴结核、秃疮、疮疖疥癣、痈疽。该植物富含多种生物碱，已被证明具有镇静止痛、抗肿瘤、抗菌等多种生物活性。但是，到目前为止，尚未见到任何关于秃疮花提取物抗植物病原菌活性的研究报道。

虽然秃疮花在我国具有丰富的天然资源，但却长期未能得到有效利用。这可能主要与人和动物均不食用该植物有关。因此，本发明既为秃疮花的开发利用提供了一条有效的途径，也为我国提供了一种新型植物源农用抗菌剂，同时也为广大农民提供了一条新的致富途径。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种秃疮花提取物及其提取方法与应用，此类药物对多种植物病原菌具有良好的抑制活性。

本发明所采用的技术方案为：

秃疮花提取物，其特征在于：

该提取物为罂粟科（Papaveraceae）秃疮花属（Dicranostigma）多年生草本植物秃疮花（Dicranostigma leptopodum (maxim.）fedde）的全草或地上部分的醇提物或水提物。

所述秃疮花提取物中包含有抗菌成分，包括木兰花碱、白屈菜红碱、血根碱、紫堇定碱、异紫堇定碱、黄连碱和原阿片碱。

如所述的秃疮花提取物的应用，其特征在于：

该提取物作为制备植物抗菌药物的应用。

该提取物对以下植物病原菌具有显著的抑制活性：

苹果腐烂病原菌；小麦赤霉病原菌；番茄早疫病原菌；玉米弯孢病原菌；南瓜枯萎病原菌；棉花枯萎、西瓜枯萎病菌；马铃薯干腐病原菌；白菜黑斑病菌；烟草赤星病菌；苹果炭疽病菌；水稻稻瘟病菌；苹果轮纹病菌；番茄灰斑病菌。

如所述的秃疮花提取物的提取方法，其特征在于：

包括以下步骤：

步骤一：以乙醇、甲醇或水为溶剂，对秃疮花植物材料进行加热提取，合并多次提取的提取液，室温静置过夜，减压滤除沉淀物，将所得滤液减压蒸除溶剂，得到提取物；

步骤二：将所得提取物溶于甲醇水溶液，依次用石油醚、氯仿和正丁醇或依次用石油醚、正丁醇进行萃取；前法所得的氯仿萃取物和正丁醇萃取物或后法所得的正丁醇萃取物即为秃疮花提取物。

步骤一中：

秃疮花植物材料与溶剂的固液混合比为1 g:15 mL，溶解温度为50-80℃，溶解时搅拌或超声波辅助；

提取液减压蒸除溶剂时的温度为30～40℃。

步骤二中：

秃疮花植物材料的提取物溶于与植物材料质量相同的、体积分数为10%～25%的甲醇水溶液中，然后依次用石油醚、氯仿和正丁醇或石油醚、正丁醇萃取，每种溶剂萃取三次；

石油醚萃取时，每次溶剂用量与被萃取液的体积相同；

氯仿萃取时，每次溶剂用量均为被萃取液体积的一半；

正丁醇萃取时，三次溶剂用量依次为被萃取液体积的50%、40%和30%。

本发明具有以下优点：

本发明所涉及的以秃疮花提取物作为有效成分的植物抗菌药物是一种植物源农药，属于生物药物的一种，符合现代社会对新农药的要求。其次，该药物具有抗菌活性强、抗菌谱广、环境友好、不易产生抗性、对人和动物毒性较低等特点。其三，该药物所涉及的植物秃疮花具有资源丰富，开发成本低的特点。其四，该发明所涉及的秃疮花提取分离技术具有生产工艺简单、生产成本低廉、环境污染小和适宜于规模化生产的优点。

附图说明

图1为秃疮花乙醇粗提物的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及一类秃疮花提取物及其含有该提取物或有效成分的药物和应用，同时涉及秃疮花有效成分的提取分离方法。本发明基于对秃疮花提取物抗菌活性及活性成分的研究，发现秃疮花提取物对多种植物病原菌具有显著的抑制活性，具有作为有效成分用于制备植物抗菌剂的潜力。同时，该发明还发现秃疮花提取物中含有以木兰花碱为主的多个有效成分，并提供了一种快速分离富集秃疮花中有效成分的方法和工艺。

上述秃疮花提取物具有如下特征：

该提取物为为罂粟科秃疮花属多年生草本植物秃疮花（Dicranostigma leptopodum (maxim.）fedde）的全草醇提物或水提物。

以上秃疮花提取物作为植物抗菌剂的应用，其特征在于：秃疮花提取物含有以木兰花碱为主，以白屈菜红碱，血根碱，紫堇定碱，异紫堇定碱、黄连碱和原阿片碱等为次的多种有效成分。

以上秃疮花抗菌有效成分的提取分离技术，其特征在于：

该提取技术涉及以醇类溶剂如乙醇、甲醇等对秃疮花植物材料进行提取，利用多种溶剂对粗提物中的有效成分进行萃取，利用色谱技术进行单体有效成分的分离。

采用菌丝生长速率法对秃疮花提取物、萃取物和单体化合物进行体外抗菌活性评价。通过与阳性药物进行比较，证明本发明所涉及的秃疮花提取物及其活性成分对多种植物病原菌存在显著的抑制活性，具有作为有效成分用于制备植物抗菌剂药物的巨大潜力。秃疮花提取物及其活性成分作为制备植物抗菌药物的应用，对以下植物病原菌具有显著的抑制活性：

苹果腐烂病原菌；小麦赤霉病原菌；番茄早疫病原菌；玉米弯孢病原菌；南瓜枯萎病原菌；棉花枯萎、西瓜枯萎病菌；马铃薯干腐病原菌；白菜黑斑病菌；烟草赤星病菌；苹果炭疽病菌；水稻稻瘟病菌；苹果轮纹病菌，番茄灰斑病菌，等。

以下结合附表、提取分离、结构鉴定和活性测定对本发明作进一步详细说明：

一、秃疮花提取物的制备及其活性成分的富集：

以95%工业乙醇、甲醇或水为溶剂，按照1:15（g/mL）的固液比，在50-80 ℃下对秃疮花全草干粉（以100 g为例）进行搅拌或超声波辅助提取，连续提取3-5次，每次2 h。每次提取结束后，趁热滤出提取液，然后对植物残渣再用新鲜溶剂进行重复提取。合并所有提取液，室温静置过夜，减压滤除沉淀物。将所得滤液在40℃下减压蒸除溶剂，到得深绿色膏状提取物24 g（A），提取率为24%。

将提取物A溶解于100 mL 25%的甲醇水溶液，依次用石油醚、氯仿和正丁醇萃取，每种溶剂连续萃取三次。石油醚每次用量均为100 mL，氯仿三次用量均为50 mL，正丁醇三次用量依次为50、40、30 mL。分别合并各相同溶剂的萃取液，并减压蒸除溶剂，依次得石油醚萃取物2.4 g（P）、氯仿萃取物2.1 g（C）和正丁醇萃取物9.8 g（B）。将正丁醇萃取后的水相减压蒸干，得水溶物9.7 g（H）。

二、秃疮花提取物中有效成分的分离与鉴定：

1. 氯仿萃取物中有效成分的分离

取1.3 g氯仿萃取物C，采用3.5×28 cm色谱柱，200-300目硅胶，干法上样，进行柱层析分离。洗脱剂依次为氯仿-甲醇（10:1; 9:1; 8:1）。依次得F1，F2（1.05 g），F3（45.2 mg），F4（29.4 mg）和F5（90.8 mg）部分。

采用相同的色谱柱和硅胶，对F1部分进行柱层析分离。洗脱剂为氯仿-乙酸乙酯（7:1; 5:1; 3:1; 2:1），得SF1（41 mg）部分。对SF1进行硅胶薄层色谱分离，展开剂为氯仿-乙酸乙酯（6:1），得单体化合物TCH-12（白屈菜红碱）（3.3 mg）、TCH-13（血根碱碱）（2.8 mg）。

将F3―F5合并，进行硅胶薄层色谱制备分离，展开剂为氯仿-甲醇（20:1），得到单体化合物TCH-7（紫堇定碱）（7.3 mg）和TCH-8（异紫堇定碱）（6.8 mg）。

2. 正丁醇萃取物中有效成分的分离

取1 g正丁醇萃取物B，用5 mL二氯甲烷，超声波处理5 min后，过滤。收集不溶物，并向其中加入5 mL甲醇，超声波处理5 min后，滤除不溶物。滤液用0.22微米超滤膜过滤，所得滤液进行C18反相柱柱层析，湿法上样。以极性递增的甲醇–水（10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%）进行梯度洗脱，10%–60%的洗脱液每个梯度约100 mL，70%–90%的洗脱液每个梯度约500 mL。将70%甲醇洗脱部分（UV365下呈黄色荧光）减压蒸干，得单体化合物TCH-11（黄连碱）。

取2.4 g正丁醇萃取物B，进行硅胶（110 g）柱色谱分离。色谱柱规格为3.5×28 cm，干法上样。洗脱剂为氯仿-甲醇（6:1; 4:1; 1:1; 1:2），得BF1―F9部分。其中BF2、BF4、BF6、BF7、BF8、BF9的质量分比为91、82、119、509、32、340 mg。

将BF6（119.4 mg）和BF7（509.5 mg）合并，用LH-20柱进行柱层析，用甲醇洗脱，依次得BF6-1（298 mg）和BF6-2（172 mg）部分。将BF6-1和BF6-2合并，进行硅胶柱层析，色谱柱规格为3.5×28 cm，硅胶为200-300目，洗脱剂依次为氯仿-甲醇 (6:1; 4:1; 3:1; 2:1)，得117 mg白色固体（TCH-3，原阿片碱）。

对BF8部分（32.3 mg）进行薄层色谱制备分离，展开剂为甲醇-水(1:1)，收集在365 nm下呈天蓝色斑点的物质，得7.6 mg淡黄色粉末状固体（TCH-4，木兰花碱）。

二、秃疮花中单体化合物的理化特性和波谱分析：

白屈菜红碱（TCH-12），黄色粉末，溶于氯仿，易溶于甲醇。遇碘化铋钾试剂显橙红色。m.p. 199–200 ℃ (H2O–MeOH); ¹³C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ107.3，151.0，150.9，105.3，121.8，133.5，152.1，120.1，147.6，151.8，127.6，120.9，130.1，127.2，119.7，63.2，57.8，132.8，134.3，104.5，53.2. ¹H-NMR (CDOD3, TMS) δ9.92 (1H, s)，8.60 (1H, d, J = 9.0 Hz)，8.56 (1H, d, J = 9.0 Hz)，8.10 (1H, d, J = 9.0 Hz)，8.08 (1H, s)，8.10(1H, d, J = 9.0 Hz)，7.49(1H, s)，6.26(2H, s)，4.97 (3H, s)，4.27(3H, s)，4.12(3H, s); ESI–MS m/z 348 [M]⁺.

血根碱（TCH-13），血红色粉末，遇碘化铋钾试剂显橙红色。m.p. 244–245 ℃ (H2O–MeOH); ¹³C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ107.2，150.6，150.6，105.2，121.8，133.0，150.7，111.1，148.1，149.3，121.4，118.4，128.9，127.4，119.8，133.0，133.9，104.3，106.5，53.2. ¹H-NMR (CDOD3) δ9.95 (1H, s)，8.57 (1H, d, J = 8.9 Hz)，8.48 (1H, d, J = 8.8 Hz)，8.19 (1H, d, J = 8.9 Hz)，8.13 (1H, s)，7.95 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.55 (1H, s)，6.54 (2H, s)，6.30 (2H, s)，4.49 (3H, s); ESI–MS m/z 332[M]⁺.

黄连碱（TCH-11），黄色粉末, 可溶于DMSO和50℃甲醇。在UV365下显黄色荧光，遇碘化铋钾试剂显橙红色。¹³C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ150.2，148.1，147.5，145.0，144.2，137.2，132.7，131.0，122.2，121.5，121.4，120.9，112.0，108.8，105.7，104.9，102.5，55.8，26.7； ¹H-NMR (CDOD3) δ9.81 (1H, s)，8.83 (1H, s)，7.97 (1H, d, J = 8.4)，7.84 (1H, d, J = 8.2 Hz)，7.71 (1H, s)，7.06 (1H, s)，6.49 (2H, s)，6.14 (2H, s)，4.85 (2H, brs)，3.19 (2H, brs)。

紫堇碱（TCH-7），白色粉末，可溶于氯仿和甲醇和丙酮。遇碘化铋钾试剂显橙红色。¹³C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ151.8，149.2，143.8，142.3，130.7，127.9，126.4，124.4，123.9，119.2，111.3，110.8，62.7，62.0，56.0，52.7，43.9，35.4，28.9；¹H-NMR (CDCl3) δ8.72 (1H, s)，7.09 (1H, d, J = 8.2 Hz)， 6.88 (1H, d, J = 8.2 Hz)，6.70 (1H, s)，3.92 (3H, s)，3.91 (3H, s)，3.74 (3H, s)，3.18 (1H, m)，3.06 (1H, d-like, J = 13.3 Hz)，3.04 (1H, d-like, J = 13.3 Hz)，2.98 (1H, d-like, J = 12.8 Hz)，2.68 (1H, d-like, J = 16.0 Hz)，2.56 (3H, s)，2.55 (1H, m)，2.44 (1H, t, J = 13.0 Hz)。

异紫堇定碱（TCH-10），无色粉末，可溶于氯仿，甲醇，在UV365下显蓝色荧光。遇碘化铋钾试剂显橙红色。¹³C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ 151.7，149.1，143.3，142.4，129.8，129.7，128.0，125.3，119.8，119.1，111.5，111.2，62.9， 60.9，55.3，55.0，52.3，42.4，34.9，28.2；¹H-NMR (CDOD3) δ 6.93 (1H, d, J = 8.1)，6.87 (1H, d, J = 8.1)，6.86 (1H, s)，3.89 (3H, s)，3.87 (3H, s)，3.65 (3H, s)，3.10 (1H, dd, J = 3.5, 13.0, Hz)，3.10 (1H, dd, J = 13.2, 3.4, Hz)，3.06 (1H, dd, J = 6.0, 11.5 Hz)，2.85 (1H, d-like, J = 13.0 Hz)，2.76 (1H, dd, J = 16.6, 3.6 Hz)，2.54 (3H, s)，2.51 (1H, 2×t, J = 4.0, 12.0 Hz)，2.38 (1H, t, J = 13.0 Hz)。

原阿片碱（TCH-3），白色粉末，可溶于氯仿，甲醇。遇碘化铋钾试剂显橙红色。¹H NMR (400 MHz,CDCl3)δ6.91 (s, 1H), 6.65 (1H, s), 2.56(4H, br s), 1.92 (3H, s), 3.59 (2H, br s), 6.67 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.68 (1H, d, J = 8.0 Hz), 3.92 (2H, br s), 5.95 (2H, s), 5.93 (2H, s); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3)δ194.9, 148.0, 146.3, 146.0, 145.9, 136.1 132.7, 128.9, 125.0, 117.8, 110.5, 108.1, 106.7, 100.8, 101.2, 57.7, 50.8, 46.4, 41.4, 31.8. EI-MS m/z 353 [M]⁺, 338, 309, 281, 267, 252, 223, 209, 190, 163, 148, 134, 91.

木兰花碱（TCH-4），淡黄色粉末，溶于氯仿，微溶于甲醇，在UV365下显蓝色荧光，与碘化铋钾试剂显红色斑点。

¹H NMR (500 MHz, CDOD3)δ6.64 (1H, d, J = 8.0 Hz)，6.35 (1H, s)，6.42 (1H, d, J = 8.0 Hz)， 3.85 (3H, s)，3.75 (3H, s)，3.62 (1H, br d, J = 14.3 Hz)，3.20 (1H, m)，3.11 (3H, s)，3.02 (2H, m)，2.82 (1H, d, J = 10.0 Hz)，2.65 (3H, s)，2.43 (1H, d-like, J = 13.0 Hz)，2.25 (1H, t, J = 13.0 Hz); ¹³C NMR (125 MHz, CDOD3)δ152.8，151.6，150.7，149.8，，126.1，123.4，123.3，117.0，115.8，，121.1，110.4，109.3， 70.8，，62.1，55.0，54.7，53.8，43.6，31.6，24.6；

三、（E）-肉桂酸酯类化合物的抗菌活性：

1、供试菌：

小麦赤霉病菌（Fusariumg graminearum）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia grisea）、玉米弯孢病菌（Curvularia lunata）、苹果腐烂病菌（Valsa mali）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium f. sp. Vasinfectum）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f. sp. Niveum）、马铃薯干腐病菌（Fusarium solani）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）、烟草赤星病菌（Alternaria alternate）、南瓜枯萎病菌（Mycosphaerella melonis）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）.

2、样品配制：

称取40 mg粗提物或萃取物，或10.0 mg的单体化合物，溶于10 mL 5%的DMSO （v/v），在超净台上用紫外灯照射灭菌30分钟后备用。

3、PDA培养基的制备：

将去皮土豆200.0 g切碎，加入1000 mL水，煮沸30 min，纱布过滤，滤液用水定容到1000 mL，加入20.0 g葡萄糖，15.0 g琼脂粉，加热使其全部溶解后，分装在三角瓶内。

4、抗菌活性的测定：

抗菌活性采用抑制菌丝生长速率法进行。将上述配制的10 mL供试液，倒入190 mL灭菌后呈熔化状态的PDA培养基中，快速混匀后趁热倒入13个无菌培养皿中，即得含50 μg/mL供试单体化合物或2.0 mg/mL提取物的培养基；以含0.25% DMSO的PDA培养基作为空白对照。当培养基凝固后，用直径为0.5 cm的打孔器从供试菌菌落边缘菌丝生长旺盛的地方制取菌饼，用接种针小心地将菌饼置于含药培养基上面。菌饼的菌丝面朝下。每皿三个菌饼，以三角形分放于培养皿的中央，然后加盖并标记后，置于25 ℃和80%湿度的培养箱中培养。每个处理重复三次。培养72 h后，采取十字交叉法测量菌落直径，取其平均值，按下面公式计算各供试化合物的抑菌率。

菌落扩展直径/cm = 菌落直径平均值 ‒ 0.5（菌饼直径）

秃疮花乙醇粗提物及各溶剂萃取物（2 mg/mL）的试验结果列于下表。结果表明，秃疮花乙醇粗提物对所有供试菌均表现出了不同程度的抑制活性，其活性成分主要集中在氯仿萃取物和正丁醇萃取物中。

秃疮花中7种单体化合物（50 μg/mL）对12种植物病原真菌的试验结果列于下表。各化合物的名称及编号分别为：白屈菜红碱（TCH-12），血根碱（TCH-13），黄连碱（TCH-11），紫堇定碱（TCH-7），异紫堇定碱（TCH-10），原阿片碱（TCH-3），木兰花碱（TCH-4）。

结果表明，白屈菜红碱（TCH-12），血根碱（TCH-13）和木兰花碱（TCH-4）对12种植物病原真菌均具有较强的抑制活性，对个别菌的活性优于阳性药物噻菌灵。

木兰花碱对7种植物病原菌的毒理方程及半数有效浓度（EC50）值列于下表。结果表明，木兰花碱对7种植物病原菌的EC50为10-38 μg/ml，平均EC50为23.4μg/ml，具有直接作为植物抗菌有效成分用于制备植物抗菌药物的潜力。

图1为秃疮花乙醇粗提物的高效液相色谱图。结果表明，秃疮花乙醇粗提物的主要成分为异紫堇定碱、木兰花碱和黄连碱，三者在秃疮花中的含量分别为1.14%、0.2%、0.095%。其他成分的含量较少。

综合各单体化合物的活性和其在秃疮花中的含量，可以确定秃疮花中的主要抑菌称为木兰花碱。

由此可见，本发明涉及的秃疮花提取物及其有效成分对植物病原菌具有较宽的抗菌谱和较强的抗菌活性，具有用于制备植物抗菌药物的潜在用途，可作为植物抗菌药物的有效成分。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。