一种猪卵巢颗粒细胞原代培养的方法与流程

本发明涉及细胞培养方法，具体涉及一种猪卵巢颗粒细胞原代培养的方法，属于细胞分离纯化和培养技术领域。

背景技术：

卵巢颗粒细胞是卵巢次级卵泡发育至囊状卵泡过程中随着卵泡腔的扩大和卵泡液增多，在卵泡腔内壁由卵泡膜细胞分化而成的一种细胞，因这种细胞胞浆中含颗粒样物质，故称其为颗粒细胞。颗粒细胞与卵母细胞之间存在信号与物质的双向交流，颗粒细胞对卵母细胞的生长发育起着支持和滋养作用。

颗粒细胞是研究雌性生殖细胞生物学及其功能调控的重要模型，而猪与人在遗传上具有高度同源性，猪卵巢颗粒细胞的研究可为人类的不孕不育提供极好的参考资料。通过屠宰场可长期稳定的获得猪卵巢，收集卵巢中的颗粒细胞进行体外试验，可为颗粒细胞的生理功能及细胞活动研究提供材料。现有的文献所报道的猪卵巢颗粒细胞的体外原代培养方法不一，但大都存在耗时、不纯或细胞存活率低等问题。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种猪卵巢颗粒细胞原代培养的方法，该方法不仅能够高效、快捷的培养出猪卵巢颗粒细胞，而且培养得到的颗粒细胞的纯度和存活率都较高。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种猪卵巢颗粒细胞原代培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：

Step1：在本地屠宰场收集初情期小母猪卵巢，将卵巢置于装有37℃的溶液I的保温容器中，两小时内送至实验室；

Step2：使用注射器在离卵泡基部0.5mm处向卵泡进针，抽吸卵泡液，将卵泡液转至无菌离心管中，500×g、5min离心收集细胞；

Step3：用溶液II重悬细胞，离心收集细胞，并用移液器反复吹吸以使细胞分散，重复此过程2-3遍，最后用溶液III重悬细胞；

Step4：通过台盼蓝染色和血球计数板检测活细胞数目，调整颗粒细胞浓度，然后将颗粒细胞置于细胞培养板内，放于37℃、饱和湿度、5％CO₂的培养箱中培养；

Step5：培养24h后细胞换液，吸走溶液III、未贴壁细胞和卵母细胞，并用溶液I润洗一次，加入新鲜的溶液III继续培养，细胞每培养24h换液一次，相差倒置显微镜下观察细胞汇合率达到40-50％时可进行相应的原代细胞处理或继续培养。

前述的方法，其特征在于，前述溶液I为：1×PBS溶液；前述溶液II为：含1×抗生素的DMEM/F12培养液；前述溶液III为：细胞完全生长培养液。

前述的方法，其特征在于，前述细胞完全生长培养液由DMEM/F12培养液、FBS和抗生素组成，其制备方法为：

将DMEM/F12培养液与FBS按照9:1的体积比混合，然后添加适量的1×抗生素，混合均匀。

前述的方法，其特征在于，在Step4中，将颗粒细胞置于细胞培养板内的具体操作为：

将颗粒细胞置于6孔培养板内，培养板内溶液III的终量为2ml/孔，细胞的浓度为1.65×10⁶个活细胞/孔；或者，将颗粒细胞置于24孔培养板内，培养板内溶液III的终量为0.5ml/孔，细胞的浓度为0.38×10⁶个活细胞/孔。

本发明的有益之处在于：

(1)在颗粒细胞的收集过程中，省去了在体式显微镜下用口吸管捡取卵母细胞的步骤，卵母细胞在培养液中为悬浮生长，培养皿中少量卵母细胞在培养24h后随着换液一起被吸走，贴壁的颗粒细胞即为纯净的颗粒细胞；

(2)由于省去了捡卵的步骤，所以缩短了体外操作时间，提高了颗粒细胞的分离效率，进而提高了颗粒细胞的存活率；

(3)由于贴壁的颗粒细胞即为纯净的颗粒细胞，所以与传统的切割法获得的颗粒细胞相比，更加纯净，避免了卵巢体细胞的污染；

(4)本发明的培养方法，能够帮助初次进行细胞培养的研究人员顺利的建立稳定的猪颗粒细胞体外原代培养体系。

附图说明

图1是培养6h的原代猪颗粒细胞；

图2是培养24h的原代猪颗粒细胞；

图3是培养48h的原代猪颗粒细胞；

图4是培养72h的原代猪颗粒细胞。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一、配制溶液

溶液I：1×PBS溶液。

溶液II：含1×抗生素的DMEM/F12培养液。

溶液III：细胞完全生长培养液。

细胞完全生长培养液(溶液III)的配制方法：将DMEM/F12培养液与FBS按照9:1的体积比混合，然后添加1×抗生素，混合均匀即得。

二、收集卵巢

在本地屠宰场收集初情期小母猪卵巢，将卵巢置于装有37℃的、无菌的溶液I的保温容器中，两小时内送至实验室。

三、抽取卵泡液

使用20ml、18g针头的注射器在离卵泡基部0.5mm处向卵泡进针，抽吸卵泡液，将卵泡液转至50ml无菌离心管中。

四、收集颗粒细胞

将卵泡液500×g、5min离心，去掉上清液，收集细胞。

用50ml溶液II重悬细胞，离心收集细胞，并用移液器反复吹吸以使细胞分散，重复此过程2-3遍，最后用溶液III重悬细胞。

五、台盼蓝计数

将100μl细胞悬液与100μl台盼蓝等体积混匀于1.5ml离心管中，在盖好盖玻片的血球计数板上方凹槽内加入10μl上述混合液，于10×10倍显微镜下观察，死细胞染为蓝色，活细胞不染色，计数四个大方格的细胞总数，再除以4，再乘以稀释倍数，最后再乘以10⁴，即为细胞悬液中所含有的细胞数。

若细胞位于计数板的线上，则只计算上线与右线的细胞数，或者只计算下线与左线的细胞数。

六、培养颗粒细胞

将颗粒细胞置于24孔(或者6孔)细胞培养板内，培养板内溶液III的终量为0.5ml/孔(或者2ml/孔)，细胞的浓度为0.38×10⁶个活细胞/孔(或者1.65×10⁶个活细胞/孔)，放于37℃、饱和湿度、5％CO₂的培养箱中培养。

七、换液、培养

培养24h后，颗粒细胞换液，吸走溶液III、未贴壁细胞和卵母细胞，并用溶液I润洗一次，加入新鲜的溶液III继续培养，细胞每培养24h换液一次。

分别于培养6h、24h、48h、72h在相差倒置显微镜下观察细胞生长状态，当颗粒细胞汇合率达到40-50％时，即可进行相应的原代细胞处理或继续培养。

图1是培养6h的原代猪颗粒细胞。此时颗粒细胞已经贴壁，细胞呈现球形或椭圆形，贴壁细胞折光性好。

图2是培养24h的原代猪颗粒细胞。此时部分颗粒细胞已经变成梭形，颗粒细胞汇合率达到40-50％。

图3是培养48h的原代猪颗粒细胞。此时大部分颗粒细胞已经呈梭形。

图4是培养72h的原代猪颗粒细胞。此时颗粒细胞几乎占据培养皿全部的细胞生长表面，细胞的汇合率达到90％，细胞呈长梭形。

由此可见，培养24h后，颗粒细胞汇合率达到40-50％，此时即可进行相应的原代细胞处理或继续培养。

采用本发明的方法培养颗粒细胞时，在颗粒细胞的收集过程中，我们省去了在体式显微镜下用口吸管捡取卵母细胞的步骤，而是让卵母细胞在培养液中悬浮生长，采用此种方法后，培养皿中少量卵母细胞在培养24h后随着换液一起被吸走，所以贴壁的颗粒细胞即为纯净的颗粒细胞。

由于省去了在体式显微镜下用口吸管捡取卵母细胞的步骤，所以本发明的方法缩短了体外操作时间，提高了颗粒细胞的分离效率，进而提高了颗粒细胞的存活率。

此外，由于贴壁的颗粒细胞即为纯净的颗粒细胞，所以与传统的切割法获得的颗粒细胞相比，采用本发明的方法获得的颗粒细胞更加纯净，有效避免了卵巢体细胞的污染。

因此，本发明的培养方法能够帮助初次进行细胞培养的研究人员顺利的建立稳定的猪颗粒细胞体外原代培养体系。

综上所述，本发明的培养方法不仅能够高效、快捷的培养出猪卵巢颗粒细胞，而且培养得到的颗粒细胞的纯度和存活率都较高，可建立稳定的猪颗粒细胞体外原代培养体系，为猪颗粒细胞的营养生理、代谢及其机制研究提供基础和高效快捷的手段，意义重大。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。