戊唑醇农药降解菌和基于该菌的土壤生物修复菌剂及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种戊唑醇农药降解菌和基于该菌的土壤生物修复菌剂及其应用，其是利用微生物的技术降解化学农药残留，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工。

背景技术：

戊唑醇是一种羟乙基三唑类衍生物，该化合物是由德国拜耳公司于1986年最先开发成功的新一代高效广谱型内吸性杀菌剂，是用于重要经济作物的种子处理或叶面喷洒的高效、低毒、内吸性杀菌剂，可有效防治禾谷类作物的多种锈病、根腐病、赤霉病、纹枯病、稻曲病及多种黑穗病等。

然而，在广泛使用过程中必然伴随其在环境中的残留，当其长期大量使用时必然会引起环境污染。自然界中存在许多种能够降解环境中残留农药的微生物。其具有安全、低廉、高效等特点，能有效的降解环境中残留的农药且不会对环境造成危害，因此筛选出对戊唑醇具有高效稳定降解效果的菌株，对戊唑醇农药的降解有着重要的意义。为此，本发明从长期受戊唑醇农药污染严重的淤泥及土壤环境中分离到戊唑醇降解菌，并对其降解效果进行试验，为其实际应用提供技术支持。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种戊唑醇农药残留降解菌，其分类命名为粘质沙雷氏菌H2(Serratia marcescens H2)，该菌株是一株革兰氏染色反应阴性菌，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址是：中国湖北省武汉市武汉大学，武汉市武昌珞珈山，邮编：430072)，保藏编号是CCTCC NO：M 2016478，保藏日期2016年9月13日。

该戊唑醇农药残留降解菌菌株在平板培养基上生长的菌落形态为凸起，中心不透明，边缘不规则，大小为1～2.5mm，均产生红色色素，可产生树枝状向左旋的菌落；菌体为短杆菌，大小为(1～1.3)μm×(0.7～1.0)μm，周生鞭毛、有动力，无荚膜、无芽孢。该菌株16SrDNA的Genbank登陆号为KX827591。

所述平板培养基的配方是：NaCl 10g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，调pH为7。

本发明的另一个目的是提供一种基于上述戊唑醇农药残留降解菌H2的土壤生物修复菌剂，其由如下步骤制备：

1)用接种环沾少许戊唑醇农药残留降解菌H2菌体接种于平板培养基上，在恒温箱中30℃培养48h；然后再用接种环沾少许菌体接种于LB培养基中，30℃振荡培养至对数期；所述LB培养基是：NaCl 10g、酵母粉浸粉5g、胰蛋白胨10g，加入1000mL蒸馏水，pH 7.0；

2)将上述步骤培养好的菌种接入种子瓶，用量为5～10mL菌种/1000mL种子瓶培养基，振荡培养至对数期，1000mL种子瓶培养基的重量百分含量是：蔗糖0.2～0.7％、K₂HPO₄0.1～0.2％、KH₂PO₄ 0.05～0.15％、MgSO₄·7H₂O 0.02～0.04％、NH₄NO₃ 0.1～0.2％、CaCl₂·2H₂O 0.002～0.003％、Fe₂(SO4)₃ 0.0005～0.001％，余量为水，pH 7.0；

3)将上述步骤培养好的菌种，加入到由麦麸、聚乙烯醇、海藻酸钠、活性炭组成的发酵培养基中，用量为15～20mL菌种/1000g发酵培养基，同时把15～20mL的营养液加入到上述1000g发酵培养基中，在30℃下进行通风发酵48h，并将发酵物在30℃下进行通风干燥，粉碎后进行包装，即得到基于戊唑醇农药残留降解菌H2的土壤生物修复菌剂；

每1000g发酵培养基的组成按重量百分比是：麦麸55～60％、聚乙烯醇15～20％、海藻酸钠10～15％、活性炭5～10％；

每100mL营养液组成按重量百分比是：蔗糖0.5～0.7％、KH₂PO₄ 0.1～0.15％、MgSO₄·7H₂O 0.02～0.04％、K₂HPO₄ 0.1～0.2％、NaCl 0.1～1％、酵母浸粉0.1～0.2％、余量为水，pH自然；

本发明的另一个目的，是提供上述土壤生物修复菌剂在土壤生物修复中的应用。

具体实验如下，首先称取土壤1000g，加入由戊唑醇原药制成的水溶液，使土壤中戊唑醇的浓度为200mg/kg(即配制成被戊唑醇污染的土壤)，将本发明所述土壤生物修复菌剂按重量百分比为10％施于该土壤中，充分混匀，放于30℃的黑暗培养箱中恒温培养，定时取样测定戊唑醇在土壤中的残留。结果参见图1。

选取黄瓜种子为供试作物。分别配制含戊唑醇浓度为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的含药土壤(每盆1000g土壤)，使含水量为20％左右，将本发明所述土壤生物修复菌剂按重量百分比为10％比例散施在上述土壤中充分混合，同时分别设空白组(不加戊唑醇、不加修复菌剂的土壤)和加药组(加戊唑醇、不加修复菌剂的土壤)做为对照组，取清水浸种催芽萌发一致的黄瓜种子，播种于不同处理土壤中，每盆20粒，置于室内培养7d，适时喷水保湿，测量不同处理黄瓜的株高、根长。结果参见图2、图3。

本发明的有益效果如下：

1、本发明提供了一种戊唑醇的降解菌，土壤降解实验表明，对戊唑醇降解率可达88％。该菌剂具有生产成本低、降解效果好、使用方便等优点。适用于消除土壤中的农药残留，对保护生态环境和食品安全具有重要意义。

2、生物修复实验表明，以黄瓜做为供试作物，戊唑醇浓度为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的含药土壤中分别施加该菌剂后，根长分别提高19％、22％、30％，株高分别提高16％、25％、32％。

附图说明

图1：本发明所述土壤生物修复菌剂对土壤中戊唑醇降解的影响曲线；

图2：本发明所述土壤生物修复菌剂对黄瓜株高的影响曲线；

图3：本发明所述土壤生物修复菌剂对黄瓜根长的影响曲线；

图4：不同pH条件下H2菌株对戊唑醇的降解曲线；

图5：不同温度条件下H2菌株对戊唑醇的降解曲线；

图6：不同初始浓度下H2菌株对戊唑醇的降解曲线；

图7：诱导作用对菌株H2对戊唑醇的影响。

具体实施方式

实施例1：戊唑醇降解菌的富集、分离、纯化及菌悬液的制备

取5g土壤样品(多年使用戊唑醇)加入盛有100mL无机盐培养基的三角瓶中，从配制浓度为10000mg/L的戊唑醇的甲醇溶液中取1mL直接加到该三角瓶中作为微生物生长的唯一碳源(100mg/L)，在摇床上培养7d(30℃，150r/min)后转接至含戊唑醇200mg/L的无机盐培养基中培养7d后，再分别依次转接至含戊唑醇300mg/L、500mg/L、800mg/L和900mg/L无机盐培养基中培养，每个含药浓度培养7d后，然后在含戊唑醇为400mg/L的平板培养基上接入上述培养基0.1mL，涂布后于30℃培养箱中培养2d，挑出单菌落在平板培养基上重复转接划线4次进行纯化，将纯化后菌株用接种环沾取少许接种于100mL的LB液体培养基中，30℃、150r/min的摇床中振荡培养48h，取适量菌液离心，弃去上清液，用无菌水洗涤沉淀2次，用等量的无菌水悬浮，得H2菌悬液备用。

所述的无机盐培养基配方是：K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 1g，NH₄NO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂·2H₂O 25mg，Fe₂(SO4)₃ 8mg，pH自然，加1000mL蒸馏水。

从上述纯化好的菌株中获得一株戊唑醇降解菌，该降解菌为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的H2菌株。其在CCTCC的保藏编号是M 2016478。该降解菌菌株革兰氏阴性，在平板培养基上生长的菌落形态为凸起，中心不透明，边缘不规则，大小为1～2.5mm，均产生红色色素。可产生树枝状向左旋的特别菌落；菌体为短杆菌，大小为(1～1.3)μm×(0.7～1.0)μm，周生鞭毛，有动力，无荚膜，无芽孢。该菌株16SrDNA的Genbank登陆号为KX827591。

实施例2：降解条件

1、pH对菌株H2降解戊唑醇的影响

按体积百分比为4％接菌量，将实施例1制备的H2菌悬液接入戊唑醇浓度为200mg/L的无机盐培养基中，分别用盐酸和氢氧化钠溶液调节培养基的pH值为3、5、7、9、11，在30℃、150rpm摇床振荡培养，分别在1、2、4、6、8d测定戊唑醇的含量。

所述无机盐培养基配方是：K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 1g，NH₄NO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O0.3g，CaCl₂·2H₂O 25mg，Fe₂(SO4)₃ 8mg，pH自然，1000mL蒸馏水。

pH对菌株降解戊唑醇的实验结果表明，当pH为7.0时，6d降解率最高达到91.25％，随着pH值升高或降低，戊唑醇降解效率逐渐下降。表明该菌能适应中性的培养基。结果参照图4。

2、温度对菌株H2降解戊唑醇的影响

温度实验中，选用五种不同温度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，在戊唑醇浓度为200mg/L无机盐培养基中，按体积百分比为4％接入实施例1制备的H2菌悬液，150rpm摇床震荡培养，分别在1、2、4、6、8d取样测定戊唑醇的含量。

所述无机盐培养基配方是：K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 1g，NH₄NO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O0.3g，CaCl₂·2H₂O 25mg，Fe₂(SO4)₃ 8mg，pH自然，1000mL蒸馏水。

在20～40℃培养条件下，分别测定菌株H2对戊唑醇的降解率。菌株H2降解戊唑醇的最适温度为30℃，该菌对戊唑醇的最佳降解温度为30℃，6d降解率达到92.25％。而20℃和40℃降解率只有13.71％～42.36％。表明低温或高温影响菌株对戊唑醇的降解能力。结果参照图5。

3、戊唑醇的初始浓度对菌株H2降解戊唑醇的影响

在无机盐培养基中加入戊唑醇溶液，使其终浓度分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、500mg/L，以体积百分比为4％的接菌量接入实施例1制备的H2菌悬液，30℃、150rpm摇床震荡培养，分别在1、2、3、4、5、6、7、8d取样，测定戊唑醇的降解率。结果参见图6和表1。

表1 H2菌株降解戊唑醇一级动力学方程

实验结果表明，H2对100～300mg/L戊唑醇降解效果较好，都达到50％以上。尤其戊唑醇浓度200mg/L时降解率最高达到90％以上，当戊唑醇浓度50mg/L和500mg/L时，降解率有所下降只有22.6％～34.2％。由表1可以看出，当戊唑醇浓度分别为50，100，200，300，500mg/L时，其降解动态符合农药降解动力学方程C＝C₀*e^-kt(C时间t时的农药浓度，C0初始浓度，t降解时间，k降解的速率常数)，当戊唑醇浓度为200mg/L时，降解的速率常数是0.685，半衰期是1.01d，说明200mg/L是最佳降解浓度。

所述无机盐培养基配方是：K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 1g，NH₄NO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂·2H₂O 25mg，Fe₂(SO4)₃ 8mg，pH自然，1000mL蒸馏水。

4、诱导作用对戊唑醇降解的影响

将菌株H2分别接种在不含戊唑醇的LB液体培养基和含戊唑醇浓度为200mg/L的LB液体培养基，分别培养48h，然后离心弃去上清液，用无菌水洗涤沉淀2次，用等量的无菌水稀释制成菌悬液，并按体积百分比为4％定量接种于戊唑醇浓度为200mg/L无机盐培养基中，30℃、150rpm摇床振荡培养，分别在1、2、4、6、8d后取样，测定戊唑醇浓度。

所述无机盐培养基配方是：K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 1g，NH₄NO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂·2H₂O 25mg，Fe₂(SO4)₃ 8mg，pH自然，1000mL蒸馏水。

菌株H2在LB培养基上培养后，将其接种到含有戊唑醇的无机盐培养液中培养6天，戊唑醇的降解能力显著下降，仅为57.39％，而经过戊唑醇诱导后菌株培养6天，戊唑醇降解率达到90.17％。这说明底物戊唑醇对其菌株H2降解活性具有诱导作用，在不含有戊唑醇的环境中长期培养，所获得的菌株则可能会丧失其对戊唑醇的降解代谢活性，说明降解菌H2能以戊唑醇为唯一碳源。结果参照图7。

综上研究表明，环境温度和pH值对H2菌株的降解特性影响较大，当pH值为7.0、温度为30℃时，H2菌株对戊唑醇的降解率最高，超过这个范围，降解率明显下降。研究发现，H2菌株的降解能力由戊唑醇诱导而产生，戊唑醇诱导的最适合浓度为200mg/L。在此条件下，6d降解率可达90％以上。当戊唑醇浓度50mg/L和500mg/L时，菌株降解戊唑醇能力有所下降。这是由于高浓度的戊唑醇对降解菌产生了抑制作用，而低浓度时农药无法提供充足的碳源而影响菌体生长所致。当戊唑醇初始浓度为50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、500mg/L时，符合农药降解动力学方程。菌株H2对戊唑醇的降解能力是符合一级动力学方程。

实施例3：土壤生物修复菌剂的制备

在戊唑醇降解菌H2的斜面试管菌种中用接种环沾少许菌体接种于平板培养基上，30℃培养48h后，再用接种环沾少许菌体接种于LB培养基中，30℃振荡培养至对数期，所述平板培养基的配方按重量百分含量是：NaCl 10g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、琼脂15g，加入1000mL蒸馏水；所述LB培养基是：NaCl 10g、酵母浸粉5g、胰蛋白胨10g，加入1000mL蒸馏水；将培养好的菌种10mL接入种子瓶，振荡培养至对数期；1000mL的种子瓶培养基为：蔗糖2g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，NH₄NO₃ 1g，CaCl₂·2H₂O 25mg，Fe₂(SO4)₃ 8mg，pH 7.0，1000mL蒸馏水。

将上述培养好的菌种15mL加入到由麦麸、聚乙烯醇、海藻酸钠、活性炭组成的1000g的发酵培养基中，同时加入营养液15mL，在30℃下进行通风发酵48h，将发酵物在30℃下进行通风干燥，粉碎后进行包装，包装制成产品，即得到基于上述H2菌株的土壤生物修复菌剂。

1000g发酵培养基配方是：麦麸600g、聚乙烯醇200g、海藻酸钠150g、活性炭50g；1000mL营养液配方是：蔗糖5g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，K₂HPO₄1.5g，NaCl 1g，酵母浸粉2g，余量为水，pH自然。

实施例4：生物修复

降解菌菌剂的生物修复作用对敏感作物影响

黄瓜种子作为供试作物，选取经清水浸种催芽萌发一致的黄瓜种子备用。配制戊唑醇溶液放入花盆中(每盆1000g土)，加入适量的水，使含水量为20％左右，将实施例3制备的土壤生物修复菌剂施在土壤中。处理一：取风干土(过20目筛)1.0kg，加入适量的水，使含水量为20％。处理二：分别取风干土(过20目筛)1.0kg，加入戊唑醇溶液，充分拌匀后制成戊唑醇浓度分别为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的含药土壤，再加入重量百分比为10％的基于上述H2菌株的生物修复菌剂，混匀。处理三：取风干土(过20目筛)1.0kg，加入戊唑醇溶液，充分拌匀后制成戊唑醇浓度分别为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的含药土壤。

从已经浸种催芽的种子中选取萌发一致的黄瓜种子，播种于不同处理土壤中，在25℃室内培养7d。同时观察记录不同处理土壤黄瓜的株高、根长。

降解菌固体菌剂的生物修复作用对敏感作物的影响：实验结果表明含药土壤施用菌剂后可以明显提高黄瓜株高、根长。当土壤中戊唑醇浓度分别为50mg/kg，、100mg/kg、200mg/kg时，加入质量分数为10％的菌剂后，黄瓜的株高和根长明显高于未施用菌剂处理培养的黄瓜，株高分别提高16％、25％、32％，根长分别提高19％、22％、30％，表明H2菌剂对土壤中戊唑醇有较好的降解作用，提高黄瓜株高、根长。同时土壤中戊唑醇的残留对黄瓜的生长有明显的抑制作用，施用H2菌剂后黄瓜的药害作用明显减轻，加菌处理含药土壤中黄瓜株高、根长均明显高于未加菌处理植株。表明H2菌剂对黄瓜的生长有明显的解除药害的作用。结果参照图2和图3。