本发明属于微生物检测领域，尤其涉及一种肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测引物及试剂盒。
背景技术：
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)是呼吸道感染最常见的致病菌之一。我国流行病学调查显示，Mp已成为我国成人社区获得性肺炎的首要致病菌。Mp感染不但可引起呼吸道疾病，还可引起全身多器官病变，如脑炎、心肌炎、肝炎、肾炎、免疫溶血性贫血等，而且近些年来Mp引起的危重病例不断增多。由于Mp缺乏细胞壁，对常用抗生素如β-内酰胺类等药物的治疗，效果不明显。
现有医学领域对Mp的检测手段为：肺炎支原体培养、肺炎支原体核酸PCR扩增和血清学检测（lgM和lgG），这些方法耗时长、需要特殊的仪器、并且成本高。因此，亟需研究一种可以快速、准确的判断出Mp感染的方法，然后合理并具有针对性的选择抗生素进行临床治疗，及时控制感染。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种肺炎支原体滚环恒温扩增快速检测引物及试剂盒，利用滚环恒温扩增（RCA）技术可进行菌样的快速、高准确度检测。
为了实现上述目的，本发明提供一种用于检测肺炎支原体的引物，是根据肺炎支原体P1基因的特异性保守靶序列设计的，所述引物由四条引物组成，包括前端内引物SIP，后端内引物ASIP，外引物S和AS；其中S引物位于SIP上游，AS引物位于ASIP下游；在带有链置换功能的Bst DNA聚合酶作用下，四条引物以肺炎支原体基因组DNA为模板，扩增出一条单链DNA目标模板。单链DNA目标模板在桥引物BP的帮助下，被DNA连接酶连接环化，通过与环化DNA目标模板互补的桥引物BP，启动肺炎支原体基因组DNA滚环复制，每一轮滚环复制的产物又可以被DNA连接酶连接环化，产生级联放大的循环扩增。
所述的肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测引物的核苷酸序列如下。
外引物S：SEQ ID NO：2： CGC TGC GCC ACA CCA ATG。
外引物AS：SEQ ID NO：3：AGC GGC TTT GAC CGC ATC。
内引物SIP：SEQ ID NO：4： TGA ATC CGT TAG TTT TTC TCC CGC TCT CCC AAC CCG CGC TTA ACC CCG TG。
内引物ASIP：SEQ ID NO：5： AAT AAG GAG GCG GCT GCT GGT CGG GTG GGA TCA TAC GTG GT。
桥式引物BP：SEQ ID NO：6：CTAACGGATTCAAATAAGGAGG。
为实现上述目的，本发明还提供一种肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测试剂盒，包括如下组分：10×Bst DNA聚合酶缓冲液（NEB）；MgSO4 (100 mM)；10× DNA连接酶缓冲液（Thermo）；dNTP(10mM each)；外引物S（10 µM）；外引物AS（10µM）；内引物SIP（10µM）；内引物ASIP（10µM）；桥式引物BP（10µM）；肺炎支原体基因组DNA（10 ng/µl）；Bst DNA聚合酶大片段(NEB，1600 U/mL)；DNA连接酶(Thermo，1000 U/mL)；25×钙黄绿素指示剂（钙黄绿素625µM、MnCl2 10 mM）和水。
上述试剂盒应用于临床样品肺炎支原体检测，其使用方法依次包括如下步骤。
1、提取肺炎支原体的基因组 DNA。
2、按试剂盒配方，制作肺炎支原体滚环扩增检测反应体系。
3、反应结束后进行结果判定：在反应液中加入钙黄绿素指示剂（终浓度25µM 钙黄绿素和400µM MnCl2），颜色变为绿色，表示待测样品中存在肺炎支原体（结果阳性），颜色不变，表示待测样品中不存在肺炎支原体（结果阴性）。
所述的提取肺炎支原体的基因组DNA 的OD260/OD280 在1.6-2.0范围内，浓度在10ng/μL-100ng/μL 范围内。
所述的提取肺炎支原体的基因组DNA 的OD260/OD280优选1.8。
本发明的有益效果。
滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）是最新发展起来的一种恒温核酸扩增方法。以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物，在酶催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片段。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。因此，本发明所提供的检测试剂盒针对肺炎支原体，采用了用于滚环恒温扩增反应的特异性引物，该试剂盒检测Mp的方法具有以下优势：（1）通过4条引物的6个特异性区域，对检测靶序列进行特异性识别，实现很好的检测特异性；（2）通过桥引物使检测靶序列环化，与AIP/ASIP引物共同实现靶序列级联扩增的信号放大效果，灵敏度高；（3）反应过程只需要65摄氏度的恒温进行即可，简单易用，操作方便。
本发明检测试剂盒中的序列是通过大量的实验设计出来的新基因序列，在现有的基因库中并未公开。同时，桥式引物BP可以将AIP/ASIP引物合成的产物连接环化，对形成级联扩增具有重要作用。
本发明可以用于肺炎支原体肺炎的快速检测，为临床的早期诊断和治疗提供保证，实现了快速、准确、便捷及低成本检测的重要价值。目前，国内未见有用于检测肺炎支原体的滚环扩增检测试剂盒及其专用引物。
具体实施方式
下列结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1。
对肺炎支原体标准菌株（ATCC 15531）的检测从 NCBI 的核酸数据库 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 检索获得肺炎支原体 P1 基因 (GenBank 号 ：CP002077.1)，通过 BLAST 软件进行同源性分析，获得肺炎支原体P1基因的特异性保守靶序列SEQ ID NO：1：TCG CGC TGC GCC ACA CCA ATG CCA TCA ACC CGC GCT TAA CCC CGT GAA CGT ATC GTA ACA CGA GCT TTT CCT CCC TCC CCC TCA CGG GTG AAA ATC CCG GGG CGT GGG CCT TAG TGC GCG ACA ACA GCG CTA AGG GCA TCA CTG CCG GCA GTG GCA GTC AAC AAA CCA CGT ATG ATC CCA CCC GAA CCG AAG CGG CTT TGA CCG CAT CAA。
根据该保守靶序列设计（可以找到对应的序列，通过与靶序列比对设计）滚环扩增引物：外引物S：SEQ ID NO:2：CGC TGC GCC ACA CCA ATG；外引物AS: SEQ ID NO:3：AGC GGC TTT GAC CGC ATC；内引物SIP：SEQ ID NO:4: TGA ATC CGT TAG TTT TTC TCC CGC TCT CCC AAC CCG CGC TTA ACC CCG TG；内引物ASIP：SEQ ID NO:5: AAT AAG GAG GCG GCT GCT GGT CGG GTG GGA TCA TAC GTG GT。；桥式引物BP：SEQ ID NO:6: CTA ACG GAT TCA AAT AAG GAG G。
上述肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测试剂盒，包括如下组分：10×Bst DNA 聚合酶缓冲液(200 mM Tris-HCl、100 mM (NH4)2SO4、100 mM KCl、20 mM MgSO4、1% Triton® X -100)；MgSO4(100 mM)；10×DNA连接酶缓冲液（400 mM Tris-HCl、100 mM MgCl2、100mM DTT、 5mM ATP）；dNTP(10mM each)；外引物S（10 µM）；外引物AS（10µM）；内引物SIP（10µM）；内引物ASIP（10µM）；桥式引物BP（10µM）；肺炎支原体基因组DNA（10 ng/µl，每次用量1µl）；Bst DNA聚合酶大片段(NEB 1600 U/mL)；DNA连接酶(Thermo 1000 U/mL)；25×钙黄绿素指示剂（钙黄绿素625µM、MnCl2 10 mM）和水。
检测方法包括以下步骤。
1、待检测样品DNA模板的提取：采用的支原体DNA提取试剂盒，提取待检样品DNA：OD260/OD280 在1.6～2.0范围内（1.8为最佳值）， 浓度在10ng/μL～100ng/μL 范围内。
2、将待检测样品DNA模板按配方将各组分加到同一个PCR管中，用移液器轻轻吹打3次混匀，在恒温水浴锅或者恒温器中，温度控制在65℃条件下，扩增1小时，反应体系中各成分用量如下。
10× Bst DNA聚合酶缓冲液 2µl、10×DNA连接酶缓冲液2µl、MgSO4（100 mM）2µl、dNTP(10mM each) 1µl、外引物S（10µM）1µl、外引物AS（10µM）1µl、内引物SIP （10µM）2µl、内引物ASIP（10µM）2µl、桥式引物BP（10µM）2µl、肺炎支原体基因组DNA 1µl、Bst 聚合酶大片段 (NEB 1.6 U/ul) 1µl、DNA连接酶(1 U/ul) 0.5µl、H2O 2.5µl。
3、反应结果判定：滚环恒温扩增反应产物通过钙黄绿素指示剂进行检测（核酸扩增过程会形成大量焦磷酸根离子，荧光燃料中的锰离子与钙黄绿素结合导致荧光猝灭，同时燃料颜色为橙色，当扩增反应形成焦磷酸根离子时，锰离子与焦磷酸根离子结合形成焦磷酸锰，引起荧光信号的产生，同时染料颜色变为黄绿色），反应结束后加入钙黄绿素指示剂（终浓度25µM 钙黄绿素和400 µM 氯化锰溶液）。颜色变为绿色，表示待测样品中肺炎支原体阳性，颜色不变，表示待测样品中肺炎支原体阴性。
1.对实施例1中肺炎支原体检测方法的灵敏度检测。
将总量为106拷贝的肺炎支原体基因组DNA进行1：10梯度稀释，获得含1个至105个基因组DNA拷贝的独立样品，用本试剂盒按实例1中方法进行检测。阴性对照不含肺炎支原体基因组DNA。检测结果：从含10个拷贝的样品起，可观察到绿色的产生，该绿色随样品中基因组DNA拷贝数的增加而增加，表明本发明方法可以实现10个拷贝肺炎支原体基因组DNA的检测灵敏度。
2.对实施例1中肺炎支原体检测方法的准确性检测。
通过对比实施例1与已有商品化DNA检测试剂盒对肺炎支原体的检测，进行实施例1的准确性检测。作为对照使用的商品化DNA检测试剂盒从北京蓝谱公司采购，为LAMP DNA扩增试剂盒，肺炎支原体检测扩增引物参考中国专利“用于检测肺炎支原体的LAM P试剂盒及其专用引物”（专利号CN201510666616.7）获得。通过对8个临床样品的检测发现，本发明方法与已商品化的检测试剂盒获得一致的检测结果，表明本方法的检测结果准确性高。
本发明的引物和试剂盒还可以对痰液、咽试纸等其它的样品进行肺炎支原体的检测。
序列表
＜110＞沈阳优宁生物科技有限公司
＜120＞一种肺炎支原体的滚环恒温扩增快速检测引物及试剂盒
＜160＞6
＜210＞1
＜211＞210
＜212＞DNA
＜213＞肺炎支原体P1基因的特异性保守靶序列
＜400＞1
tcgcgctgcg ccacaccaat gccatcaacc cgcgcttaac cccgtgaacg tatcgtaaca 60
cgagcttttc ctccctcccc ctcacgggtg aaaatcccgg ggcgtgggcc ttagtgcgcg 120
acaacagcgc taagggcatc actgccggca gtggcagtca acaaaccacg tatgatccca 180
cccgaaccga agcggctttg accgcatcaa 210
＜210＞2
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞外引物S
＜220＞
＜223＞
＜400＞2
cgctgcgcca caccaatg 18
＜210＞3
＜211＞18
＜212＞DNA
＜213＞外引物AS
＜220＞
＜223＞
＜400＞3
agcggctttg accgcatc 18
＜210＞4
＜211＞50
＜212＞DNA
＜213＞内引物SIP
＜220＞
＜223＞
＜400＞4
tgaatccgtt agtttttctc ccgctctccc aacccgcgct taaccccgtg 50
＜210＞5
＜211＞35
＜212＞DNA
＜213＞内引物ASIP
＜220＞
＜223＞
＜400＞5
aataaggagg cggctgctgg tcgggtggga tcatacgtgg t 41
＜210＞6
＜211＞22
＜212＞DNA
＜213＞桥式引物BP
＜220＞
＜223＞
＜400＞6
ctaacggatt caaataagga gg 22