技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种酸性环境下纤维素外切酶在乳杆菌中表达的方法。
背景技术：
纤维素酶在对生物资源的利用方面具有巨大的价值。纤维素酶能降解天然的纤维素，转化成葡萄糖，进而生产多种化工原料或生物制品。纤维素经过酸或碱的预处理能明显提高酶解的效率。然而现在纤维素酶的主要生产菌株一般不能耐受较高的酸度，这样生产纤维素酶的菌株在生产纤维素酶应用的时候，必须把酸预处理和酶解分成两步，先酸处理后再调节pH为产纤维素酶菌株适宜的酸度，否则产纤维素酶菌株会因为过高的酸度死亡或衰亡。如果生产纤维素酶的菌株能够耐受较高的酸度，那么可以实现一边降解纤维素，一边生产纤维素酶，从而维持纤维素酶较高的活性。
嗜酸的微生物中，乳杆菌能在高酸度下进行正常的生长繁殖，而且乳杆菌是一种食品安全的微生物，若用乳杆菌生产纤维素酶，这样乳杆菌不仅可以高酸度体系下持续表达纤维素酶，而且不需要经过分离纯化把乳杆菌去除掉。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种酸性环境下纤维素外切酶在乳杆菌中表达的方法。本发明的目的还在于提供一种酸性环境下表达纤维素外切酶的乳杆菌。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种酸性环境下纤维素外切酶在乳杆菌中表达的方法，包括如下步骤：将由SD序列、信号肽编码序列和纤维素外切酶基因组成的表达单元，通过同源重组整合到乳杆菌基因组上；优选通过同源重组将所述表达单元置换乳杆菌基因组上的热激蛋白基因。所述的酸性环境优选pH为3.0；所述的纤维素外切酶基因优选来源于黑曲霉。
所述的SD序列优选如SEQ ID NO.1所示；所述的信号肽编码序列优选如SEQ ID NO.2所示；所述的纤维素外切酶基因的序列优选如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述的酸性环境下纤维素外切酶在乳杆菌中表达的方法，包括如下步骤：将SEQ ID NO.4所示序列通过限制性内切酶SacI、XbaI及DNA连接酶连接到pHT01载体上；用所构建的载体转化嗜酸乳杆菌CCTCCAB96031，筛选同源重组成功的菌株。
一种酸性环境下表达纤维素外切酶的乳杆菌，通过上述方法得到。
本发明以嗜酸乳杆菌为表达宿主，通过同源重组将其热激蛋白基因置换成由SD序列、信号肽编码序列和纤维素外切酶基因组成的表达单元，即将该表达单元置于高温启动的启动子下，从而让嗜酸乳杆菌在高温下启动表达纤维素外切酶。本发明实现了纤维素外切酶在嗜酸乳杆菌中的酸性条件下的温控表达。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、材料
嗜酸乳杆菌CCTCCAB96031，大肠杆菌DH5α，质粒pHT01，SEQ ID NO.4所示的DNA序列1（包括上下游同源臂、SD序列、信号肽编码序列和纤维素外切酶基因，由生物公司合成）。
质粒提取试剂盒（B518188）购自上海生物工程股份有限公司。胶回收试剂盒（Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0）、限制性内切酶和T4 DNA Ligase购自Takara公司。
MLB培养基：蛋白胨（Tryptone）10g/L，酵母提取物（Yeast extract）5g/L，牛肉膏 5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸铵2.5g/L，MgSO4 0.5g/L，MnSO4 0.25g/L，KH2PO4 0.5g/L。MLB固体培养基再加入琼脂粉15g/L。
2、质粒pHT01的提取
含有质粒pHT01大肠杆菌DH5а，在含氯霉素5mg/L的LB培养基中培养12h，培养温度为30℃，用质粒提取试剂盒（B518188）提取质粒。提取步骤如下：
（1）取0.5mL菌液，10000rpm离心3min收集菌体，倒尽或吸干培养基。
（2）在菌体沉淀中加入700μL Lysis Buffer UF，吸打或振荡至彻底悬浮菌体，室温放置3min。
（3）将裂解液全部小心移入吸附柱，室温放置1min，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
（4）向吸附柱中加入500μL Prewash Solution，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
（5）向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
（6）重复向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm 离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
（7）将吸附柱和收集管放入离心机，8000rpm离心2min。
（8）将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入50μL Elution Buffer，室温静置2min，8000rpm离心2min。将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存。
3、质粒pHT01和SEQ ID NO.4所示DNA序列1的酶切
往25µL提取的质粒pHT01中加入SacI和XbaI酶各0.2µL，加入酶切缓冲液及ddH2O 24.6µL，在30℃保温60min，加入5µL Loading Buffer，60℃保温10min，得到质粒pHT01酶切液。
DNA序列1用双蒸水稀释10倍，取25µL，加入SacI和XbaI酶各0.2µL，加入酶切缓冲液及ddH2O 24.6µL，在30℃保温60min，加入5µL Loading Buffer，60℃保温10min，得到DNA序列1酶切液。
4、酶切液电泳
（1）电泳试剂配制
1）5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制（1000mL）：Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20mL，将pH调到8.0，定容至1000mL。4℃冰箱保存，用时稀释5倍。
2）加样缓冲液的配制：0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。
3）溴化乙锭的配制：称取0.1g溴化乙锭，溶于10mL水，配成终浓度为10mg/mL的母液，4℃冰箱保存。染色时，吸取12.5μL的母液，加入250mL的水中，使其终浓度为0.5μg/mL，混合均匀。
4）100×TE缓冲液的配制：1mol/L Tris-HCl（pH8.0），100mmol/L EDTA。称取Tris 121.1g，EDTA-Na 237.23g，先用800mL双蒸水，加热搅拌溶解后，再用盐酸调pH至8.0（大约加入盐酸20mL），然后定容至1000mL。
5）100×电泳缓冲液的配制：4mol/L Tris-HCl（pH8.0），2mol/L醋酸钠，200mmol/L EDTA。称取Tris 242.2g，无水乙酸钠82.03g，EDTA-Na 237.23g，先用400mL双蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调pH至8.0（大约加入冰乙酸50mL），然后定容至500mL。用时稀释100倍。
（2）电泳方法
1）安装电泳槽：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。
2）1%琼脂糖凝胶的制备：称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化，取出摇匀。
3）灌胶：将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。
4）待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。
5）加样：将DNA样品与加样缓冲液按体积比4:1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加20μL，记录样品的点样次序和加样量。
6）电泳：安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。
7）染色和观察：取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带。
质粒pHT01酶切液电泳后，经染色观察有两条带，两条带中回收较长的条带。DNA序列1酶切液电泳后，经染色观察有一条带，回收该电泳条带。
5、酶切片段的回收和纯化
使用Takara的胶回收试剂盒购回收纯化酶切的DNA片段。在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
称量胶块重量，计算胶块体积。向胶块中加入胶块溶解液Buffer GM，Buffer GM的加量3凝胶体积。均匀混合后室温25℃溶解胶块10min。当凝胶完全溶解后，加入3M醋酸钠溶液（pH5.2）10μL，均匀混合至溶液恢复黄色。将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。0.2mL胶溶解液转移至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。将700μL的Buffer WB加入Spin Column中，室温12000rpm离心30秒钟，弃滤液。再次将700μL的Buffer WB加入Spin Column中，室温12000rpm离心30秒钟，弃滤液。将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12000rpm离心1min。将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μL灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。室温12000rpm离心1min洗脱DNA。
6、连接
连接体系为：酶切回收的DNA序列1 7µL，酶切回收的pHT01质粒1µL，T4 DNA ligase 1µL，Buffer 1µL。4℃连接24小时。
7、转化
取一管-80℃保存的大肠杆菌DH5α（不含质粒）感受态细胞50μL，置冰上融化，加入5μL上述连接产物，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min；将离心管置于42℃热击60-90秒，然后迅速置冰浴3分钟。向离心管中加入500μL液体LB培养基（不含氯霉素），混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟（150转/分钟）；目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。吸取100μL培养液加到含氯霉素5mg/L的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时。挑选单菌落，保藏得到的转化子。
转化子在含氯霉素5mg/L的LB培养基中，30℃培养12h。用质粒提取试剂盒（B518188）提取质粒。所提取质粒进行酶切、测序鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pHT01-1e。
8、质粒pHT01-1e转化嗜酸乳杆菌
（1）嗜酸乳杆菌感受态细胞的制备
培养基A（100mL）：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl 1g，山梨醇9g，pH值为6.5。
溶液B（100mL）：山梨醇9g，甘露醇9.25g，葡萄糖10g。
溶液C（10mL）：9mL溶液B+1mL甘油。
1）嗜酸乳杆菌选育
嗜酸乳杆菌CCTCCAB96031接菌种于2mL培养基A中，37℃、200rpm过夜培养，约10h。然后接种于不含抗生素的MLB平板，挑选单菌落，挑选的单菌落表面较为光滑，菌落比一般菌落大。
挑选的菌落在接菌种于2mL培养基A中，37℃、200rpm过夜培养，约10h。得到过夜培养的菌液。
2）将2mL过夜培养的菌液添加到98mL培养基A中，37℃、200rpm培养3～4h。
3）将菌液冰水浴10～15min，然后4℃、5000rpm离心10min收集菌体。
4）用20mL预冷的溶液B重悬，如此漂洗3次。
5）将洗涤后的菌体重悬于600μL溶液C中，混匀后按60μL每管分装于预冷的EP管中，得到嗜酸乳杆菌感受态细胞。
（2）电转化
将质粒pHT01-1e加入嗜酸乳杆菌感受态细胞中并冰上预冷10min后加入到预冷的电转化杯中。在电压为1.5kV（P.LENGTH＝100μs，PULSES=04，INTERVAL=555ms）条件下电击后，迅速加入500μL培养基A，再转至EP 管中，37℃、200rpm培养3h后涂布于含氯霉素5mg/L的MLB平板上。30℃培养32h，从平板上生长的单菌落中筛选同源重组成功的转化子，同源重组成功的转化子即为要构建的嗜酸乳杆菌工程菌。
将所筛选的嗜酸乳杆菌工程菌接种于装有100mL MLB培养基的250mL三角瓶中，用盐酸调节pH为3.0，30℃摇床培养24h，测培养液纤维素外切酶酶活为0.00018 U/mL，该结果表明嗜酸乳杆菌工程菌构建成功。
纤维素外切酶酶活测定方法为：取2g微晶纤维素粉末，溶于10mL 0.2M醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.8）中，加入培养液0.5mL，50℃水浴30min，DNS法（见文献，甄静, 王继雯, 谢宝恩, 等. 一株纤维素降解真菌的筛选、鉴定及酶学性质分析[J]. 微生物学通报, 2011, 38(5): 709−714.）测定生成还原糖的量。酶活定义：每分钟水解微晶纤维素生成1µM还原糖所需酶的量为1U。
9、嗜酸乳杆菌工程菌热控表达
（1）用直径约0.2cm的接种环将嗜酸乳杆菌工程菌接种于装有MLB培养基（盐酸调节pH为3.0）的250mL三角瓶中，接种量为1环/50mL，装液量为100mL。30 ℃摇床培养24h得到培养液，测得培养液纤维素外切酶酶活为0.00018U/mL。
（2）按照上述条件将嗜酸乳杆菌工程菌接种到MLB培养基（盐酸调节pH为3.0）中，先30℃摇床培养10h，再40℃培养14h得到培养液，测得培养液纤维素外切酶酶活0.0025U/mL。
从不同培养温度可以看出，在30℃下纤维素外切酶酶活较低，说明没有增强表达纤维素外切酶；在分段前期30℃后期40℃培养条件下，纤维素外切酶酶活增加，说明纤维素外切酶的表达在高温下被增强，这说明在酸性高温下可以增强纤维素酶的表达。上述内容表明本发明实现了纤维素外切酶在嗜酸乳杆菌中的热控表达。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖北工业大学
<120> 酸性环境下纤维素外切酶在乳杆菌中表达的方法
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SD序列
<400> 1
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<210> 2
<211> 90
<212> DNA
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<220>
<223> 信号肽编码序列
<400> 2
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<210> 3
<211> 1518
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 纤维素外切酶基因序列
<400> 3
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