本发明属于生物化学技术领域,具体涉及一种新型检测苯硫酚荧光分子探针的制备方法和应用。
背景技术：
苯硫酚是一类高毒性和污染化合物，研究显示，在对鱼类实验中，苯硫酚的中值致死剂量(LC50)值范围为0.01-0.4mM。苯硫酚比脂肪族硫醇毒性更大，经常暴露于苯硫酚液体和蒸气被易引起一系列严重的健康问题，包括损伤中枢神经系统，呼吸困难，肌肉无力，后肢麻痹，昏迷，甚至引起死亡。然而，高毒性的苯硫酚及其衍生物却是有用的化学品，广泛用于农药，药品和各种工业产品的制备(Anal. Chem., 2014, 86 (17), pp 8835–8841)。但是，考虑到其高毒性和及引起的环境问题，开发简单、快速、灵敏和能选择性区分苯硫酚与脂肪硫醇的荧光探针，在环境保护、食品安全和生命科学中具有重要意义。
技术实现要素：
鉴于上述情况，本发明的目的在于克服一些现有技术的不足，提供一种选择性好，能选择性区分苯硫酚与脂肪硫醇、灵敏度高，响应速度快的新型检测苯硫酚及其衍生物荧光探针的制备方法和应用。
本发明的目的还在于提供一种制备方法简单、反应条件温和、成本较低的上述荧光分子探针的合成方法，能定量检测环境、食品中苯硫酚及其衍生物和活体细胞内中苯硫酚的应用，达到对环境、食品的监测和生物体健康评估的目的。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为，一种新型检测苯硫酚荧光分子探针，其化学分子结构如(1)所示。
本发明使用的新型检测苯硫酚荧光分子探针，采用3-(2-羟乙基)-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-溴化物和2，4-二硝基氟苯在缚酸剂的存在下发生亲核取代反应，检测是基于苯硫酚活性巯基对2,4-二硝基苯反应单元的亲核取代过程，即芳香醚键作为检测基团。
一种新型检测苯硫酚荧光分子探针的制备方法，所述的荧光分子探针的制备方法包括以下步骤：
步骤1. 合成3-(2-羟乙基)-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-溴化物
a. 将1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚和2-溴乙醇溶解在乙腈中，加热搅拌回流反应24小时；
b. 将步骤a中的反应液冷至室温，过滤，用乙醚洗涤滤饼，真空干燥，或者将已冷的反应液搅拌下加入乙醚中，过滤，乙醚洗涤滤饼，真空干燥。
步骤2. 合成E-3-(2-羟乙基)-2-(4-羟基苯乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-溴化物
. 将3-(2-羟乙基)-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-溴化物和对羟基苯甲醛溶于无水乙醇中，滴加适量的催化剂，室温搅拌反应10小时；
. 将步骤中的反应液冷过滤，无水乙醇洗涤滤饼，真空干燥。
步骤3.合成11,11-二甲基-10a-(4-(2,4-二硝基苯氧基)苯乙烯基)-8,9,10a， 11-四氢苯并[e]恶唑并[3,2-a]吲哚
①.将E-3-(2-羟乙基)-2-(4-羟基苯乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-溴化物和2，4-二硝基氟苯溶于无水丙酮，加入适量的无水碳酸钾，搅拌回流反应12 小时；
②.将①中的反应液过滤，柱层析提纯，真空干燥得所述荧光探针化合物。
所述步骤中的3-(2-羟乙基)-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-溴化物和对羟基苯甲醛摩尔比为1:1.2。
所述步骤①中的E-3-(2-羟乙基)-2-(4-羟基苯乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并 [e]吲哚-3-溴化物和2，4-二硝基氟苯摩尔比为1:2。
所述的荧光分子探针的应用为在环境、食品中定量检测苯硫酚及衍生物和在细胞内分析检测成像的应用。
所述荧光探针检测苯硫酚及其衍生物的方法，包括以下步骤：
(1)、配置pH=7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液，配置1 mM的探针溶液，配置10 mM的苯硫酚及其衍生物的溶液；
(2)、用移液枪移取20 μL的1 mM的探针溶液，20 μL的10 mM的苯硫酚溶液，980 μL的乙腈，980 μL的PBS缓冲液，配成总体积(有机相和水相体积比5:5)为2 mL的溶液，同时与不加苯硫酚的空白样品形成对照，加入石英比色皿中分别测其紫外吸收变化情况；
(3)同时用相同的方法配置相应的溶液测样品的荧光发射变化情况。
在本说明书的实施例中更详细地说明了该探针的合成和检测方法。本发明的荧光分子探针使用方法没有特殊限制，通常可以在室温下将探针分子溶解在二甲基亚砜中，在乙腈和水溶液(5:5，v/v)中进行测试。
本发明的一种新型检测硫氢根离子荧光分子探针的具体特征如下：
该分子荧光探针用二甲基亚砜(DMSO)溶解，探针分子在乙腈和水溶液(5:5，v/v)中波长范围450 -600 nm基本无紫外吸收，加入苯硫酚后，探针分子产生一个以560 nm为中心的新的宽吸收峰，随着苯硫酚浓度的增高，吸收峰逐渐上升，相应地，溶液的颜色由红色变为无色，裸眼能够清楚的看到颜色的明显变化。而且，探针分子在乙腈和水溶液(5:5，v/v)中时基本无荧光，当加入苯硫酚后，探针分子有一明显的荧光发射光谱，最大发射波长在580 nm，随着苯硫酚浓度的增加，荧光逐渐增强。
本发明所述的荧光探针分子灵敏度高，荧光性能稳定，合成步骤简单，产率高，选择性好，检测速度快较其他方法快，检测限低等优点，并且适合裸眼检测，同时，该分子荧光探针不受SO32-, NO3-, NO2-, CN-, HS-，SO42-, HSO4-, HSO3-, SO32-,S2O32-, S2O82-等阴离子的干扰，重要是的不受一些脂肪硫醇的干扰，如半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(GSH)，即使在有脂肪硫醇存在的条件下，探针也对苯硫酚有很好的响应，使得该荧光分子探针在生物化学、食品检测、环境保护等分析检测领域能用于定量检测苯硫酚类化合物和活体细胞健康评估，具有潜在的实际应用价值。
附图说明
图1为本发明的荧光探针在乙腈和水溶液(体积比5:5)体系中，紫外吸收光谱随加入苯硫酚浓度增加的变化情况，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。
图2为本发明的荧光探针在乙腈和水溶液(体积比5:5)体系中，紫外吸收光谱随加入等浓度不同离子的变化情况，横坐标为不同分析离子，纵坐标为在波长560 nm处吸光度。
图3为本发明的荧光探针在乙腈和水溶液(体积比5:5)体系中，荧光发射光谱随加入苯硫酚浓度增加的变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的说明。
本发明所述的荧光分子探针的合成路线如下式所示。
实施例1
步骤1. 合成3-(2-羟乙基)-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-溴化物
a. 将10 g(47.78 mmol)1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚和7.17 g(57.34 mmol)2-溴乙醇溶解在40 mL乙腈中，加热搅拌回流反应25小时；
b. 将步骤a中的反应液冷至室温，过滤，用乙醚洗涤滤饼，真空干燥，或者将已冷的反应液搅拌下加入乙醚中，过滤，乙醚洗涤滤饼，真空干燥得产物10.5 g。
步骤2. 合成E-3-(2-羟乙基)-2-(4-羟基苯乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-溴化物
. 将1 g(2.99 mmol)3-(2-羟乙基)-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-溴化物和438.4 mg(3.59 mmol)对羟基苯甲醛溶于8 mL无水乙醇中，滴加2-3滴哌啶，室温搅拌反应10小时；
. 将步骤中的反应液冷过滤，无水乙醇洗涤滤饼，真空干燥。
步骤3. 合成11,11-二甲基-10a-（4-（2,4-二硝基苯氧基）苯乙烯基）-8,9,10a，11-四氢苯并[e]恶唑并[3,2-a]吲哚
①.将0.5g(1.14mmol)E-3-(2-羟乙基)-2-(4-羟基苯乙烯基)-1,1-二甲基-1H- 苯并[e]吲哚-3-溴化物和424.5mg(2.28mmol)2，4-二硝基氟苯溶于10mL无水丙酮，加入1.58g无水碳酸钾，搅拌回流反应12小时；
②.将①中的反应液过滤，柱层析提纯，真空干燥得所述荧光探针化合物405mg。
探针用于苯硫酚的分析检测包括以下步骤：
. 配置pH=7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液，配置1 mM的探针溶液，配置10 mM的苯硫酚及其衍生物溶液，配置1 mM的苯硫酚溶液，配置10 mM的不同阴离子溶液。溶液配置均采用去离子水配置，所有试剂均为分析纯试剂；
B. 用移液枪移取20 μL的1 mM的探针溶液，20 μL的10 mM的苯硫酚溶液，980μL的乙腈，980μL的PBS缓冲液，配成总体积(有机相和水相体积比5:5)为2 mL的溶液，同时与空白样品形成对照，加入石英比色皿中分别测其紫外吸收变化情况；
C. 用上述同样的方法检测探针的选择性；
D. 用移液枪移取20 μL的1 mM的探针溶液，20 μL的10 mM的苯硫酚溶液，980μL的乙腈，980μL的PBS缓冲液，配成总体积(有机相和水相体积比5:5)为2 mL的溶液，同时与空白样品形成对照，加入酶标板中测试其荧光变化情况，荧光探针对不同离子的选择性检测亦用此法。
实施例2
步骤1. 合成3-(2-羟乙基)-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-溴化物
a. 将50 g(238.9 mmol)1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚和35.85 g(286.7 mmol)2-溴乙醇溶解在200 mL乙腈中，加热搅拌回流反应25小时；
b. 将步骤a中的反应液冷至室温，过滤，用乙醚洗涤滤饼，真空干燥，或者将已冷的反应液搅拌下加入乙醚中，过滤，乙醚洗涤滤饼，真空干燥得产物60.01 g。
步骤2. 合成E-3-(2-羟乙基)-2-(4-羟基苯乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-溴化物
. 将2 g(5.98 mmol)3-(2-羟乙基)-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-溴化物和876.8 mg(7.18 mmol)对羟基苯甲醛溶于15 mL无水乙醇中，滴加3-4滴哌啶，室温搅拌反应10小时；
. 将步骤中的反应液冷过滤，无水乙醇洗涤滤饼，真空干燥得产物1.8g。
步骤3. 合成11,11-二甲基-10a-（4-（2,4-二硝基苯氧基）苯乙烯基）-8,9,10a，11-四氢苯并[e]恶唑并[3,2-a]吲哚
①.将1g(2.28mmol)E-3-(2-羟乙基)-2-(4-羟基苯乙烯基)-1,1-二甲基-1H- 苯并[e]吲哚-3-溴化物和849mg(4.56mmol)2，4-二硝基氟苯溶于10mL无水丙酮，加入3.16g无水碳酸钾，搅拌回流反应12小时；
②.将①中的反应液过滤，柱层析提纯，真空干燥得所述荧光探针化合物1.01g。
分析方法同实施例1。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细的介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围因由所附的权利要求来限定。