一种解淀粉芽孢杆菌及其在酱油酿造中的应用的制作方法

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其在酱油酿造中的应用，属于食品微生物技术领域。

背景技术：

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一种致癌物质，被人体持续过量摄入可能会引发肺癌、肝癌等严重肿瘤疾病，并且对人体的免疫系统造成伤害。

酱油是食品工业广泛使用的一种发酵调味品，是具有独特色、香、味的营养丰富的功能性食品，在中国已有2500年的生产历史。近年的研究结果表明，潜在的致癌物质氨基甲酸乙酯(EC)，在酱油中尤其是日式工艺所生产的酱油中广泛存在，这严重的影响了酱油的食品安全性。

酿造酱油中氨基甲酸乙酯的主要前体物质是瓜氨酸与乙醇。因此降低酱油中瓜氨酸的含量是我们降低酱油中氨基甲酸乙酯有效措施之一。在酱油生产前期，原料水解出大量精氨酸，这些精氨酸在一大类厌氧或兼性厌氧的乳酸菌的作用下，被转化为瓜氨酸。如果这些精氨酸被一些具有完整精氨酸脱亚氨基途径的菌株利用，将精氨酸转化成鸟氨酸，就能降低酱油中的瓜氨酸积累。因此，筛选一株能够耐受高盐，并且能够高效转化精氨酸且不积累瓜氨酸的菌株，对于降低酱油中氨基甲酸乙酯的含量有重要应用价值。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种可高效利用精氨酸和瓜氨酸的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JY06-E6，已于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016497，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

本发明的第二个目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌JY06-E6的培养方法，所述方法是将所述解淀粉芽孢杆菌JY06-E6接种至含80～150g/LNaCl的LB培养基，30℃静置培养24～48h。

在本发明的一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌JY06-E6培养条件为：将保藏菌株在含100g/LNaCl的LB固体培养基上划线，于37℃静置培养2d，挑取单菌落接入含100g/L NaCl的LB液体培养基，37℃静置培养36h。

本发明的第三个目的是提供一种制备酱油的方法，是将所述解淀粉芽孢杆菌JY06-E6接种至酱醪中。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是在酱油发酵的第0-3d接种解淀粉芽孢杆菌至酱醪中解淀粉芽孢杆菌达到10⁶CFU/mL至10⁸CFU/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：(1)制曲：脱脂大豆与炒麦经浸泡、灭菌、降温后，加入麸皮、面粉，并接种米曲霉孢子，培养，待曲变成嫩绿色，制曲完成；(2)发酵：成曲拌盐水，开始发酵，在发酵的起始至第0-3天内接种解淀粉芽孢杆菌，控温10-20℃，发酵第7d接种10⁷CFU/mL(最终在酱醪中的浓度)的鲁氏酵母，发酵第14d再接种鲁氏酵母至10⁷CFU/mL(最终在酱醪中的浓度)，30℃恒温发酵，第90d结束发酵。

本发明还提供所述解淀粉芽孢杆菌JY06-E6在降低食品中氨基甲酸乙酯方面的应用。

本发明还提供所述解淀粉芽孢杆菌JY06-E6在制备发酵食品、调味品、保健品中的应用。

有益效果：本发明的解淀粉芽孢杆菌JY06-E6能够在高盐条件下高效利用精氨酸和瓜氨酸，其对精氨酸的利用率达到了95.7％，不积累瓜氨酸，且具备良好的传代稳定性。将该菌株添加至酱油酿造过程中，能够使氨基甲酸乙酯的前体物瓜氨酸含量降低14.6％，有助于控制和降低酱油氨基甲酸乙酯的含量。

附图说明

图1为突变株JY06-E6的遗传稳定性；JY06，解淀粉芽孢杆菌BBE-JY06；E6，解淀粉芽孢杆菌JY06-E6；*代表传代200代后的菌株。

生物材料保藏

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JY06-E6，已于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016497，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

具体实施方式

氨基酸检测培养基：酵母膏5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl 180g/L，葡萄糖0.5g/L，Tween-801g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.05g/L，FeSO₄0.4g/L，柠檬酸三胺2g/L，CaCO₃0.1g/L，吡哆醛-5-磷酸0.05g/L，K₂HPO₄2g/L，pH 6.0。用于检测特定氨基酸时，添加待测氨基酸6g/L。

解淀粉芽孢杆菌JY06-E6培养方法：将保藏的诱变菌株在含100g/LNaCl的LB固体培养基上划线，于30℃静置培养2d，挑取单菌落接入含100g/LNaCl的LB液体培养基，30℃静置培养36h。

实施例1解淀粉芽孢杆菌的筛选

根据如下步骤进行筛选：

(1)以保藏编号为CCTCC NO:M 2015423的解淀粉芽孢杆菌BBE-JY06(简写作解淀粉芽孢杆菌JY06)作为出发菌株，将解淀粉芽孢杆菌JY06接种至LB液体培养基，37℃，220r/min摇床培养至对数生长期；

(2)将超净工作台的紫外灯打开预热15～30min；取适量菌液加入无菌培养皿中，在15W紫外灯30cm处分别照射0s、20s、40s、60s、80s、100s、120s；照射完成后将菌体转入无菌试管中并立即放入冰水中；在避光条件下，分别取照射菌液和未照射菌液进行稀释涂布，计算活菌细胞数，从而得到致死率；再培养后取适量的照射菌液加到LB培养基中，用锡箔纸包好避光，在37℃，120rpm/min恒温摇床中培养2～4h；在避光条件下将活化菌液稀释至10^-4～10^-6三个浓度，取稀释液涂布于筛选培养基中，用黑布包好避光，置于37℃恒温培养箱中培养24～36h，每个处理重复三次；挑取菌落进行精氨酸显色复筛。

移取50μL满足初筛条件的菌株所对应的上清液于1.5mL的离心管中，然后再分别向离心管中加入40g/LNaOH溶液、80g/L甲萘酚正丙醇溶液和0.5mL/L双乙酰正丙醇溶液各1mL，震荡摇匀后，放入30℃水浴锅中显色15min。取出冷却一段时间后，在分光光度计上测吸光值OD₅₄₀，以未接种的培养基作为对照。吸光值OD₅₄₀较小的菌株即为高效利用精氨酸的菌株。

实施例2解淀粉芽孢杆菌JY06-E6利用精氨酸能力分析

分别挑取平板上活化好的原始菌株解淀粉芽孢杆菌JY06和突变菌株解淀粉芽孢杆菌JY06-E6的单菌落接种于100g/LNaCl的LB液体培养基中，37℃静置培养36小时，取5mL菌液8000rpm离心1min，弃上清，所获菌体加入1mLpH7.0的磷酸盐缓冲液重悬浮。

向5mL离心管中加入4mL含10g/L的精氨酸的氨基酸检测培养基，接种500μL的悬浮菌液，接种后OD₆₀₀为7.8。30℃静置培养3天后用HPLC的方法检测培养基中精氨酸和瓜氨酸以及鸟氨酸含量

表1精氨酸代谢相关氨基酸含量

注：ΔArg(g/L)：精氨酸的消耗量；ΔCit(g/L)：瓜氨酸的生成量；ΔOrn(g/L)：鸟氨酸的生成量。

由表1可知，突变株代谢精氨酸的能力与对照相比提高了17.1％，并且精氨酸向鸟氨酸的转化率也提高了55.8％。

实施例3：解淀粉芽孢杆菌JY06-E6传代稳定性

分别将解淀粉芽孢杆菌JY06、突变株JY06-E6接种至LB液体培养基培养，37℃，220r/min培养，每隔24h转接至新的LB液体培养基中，培养20d后，取4mL菌液离心去上清，用无菌水清洗菌体两遍，加入等体积的精氨酸利用培养基，30℃静置培养3～5d。

取1mL样品，离心后取上清。用5％的三氯乙酸将上清液稀释20倍后，经孔径为0.22μm的滤膜过滤。用高效液相色谱法测定样品中精氨酸含量。

如图1所示，突变株JY06-E6对精氨酸利用情况的遗传稳定性良好。传代200代后，突变株JY06-E6代谢精氨酸的能力是原始菌株JY06的1.81倍，并且转化成鸟氨酸的能力依然高出JY060.92倍。

实施例4：酱油制作

(1)制曲：脱脂大豆与炒麦浸泡8h，121℃灭菌5min，降温至80℃，按比例加入麸皮、面粉，脱脂大豆、炒麦、麸皮、面粉的质量比为20:15:1:1，同时接入米曲霉孢子，接种量为8×10⁹个/g初始原料，30℃恒温箱中培养，6-8h翻曲一次，培养46-48h，曲变成嫩绿色，制曲完成；

(2)发酵：成曲与20％的盐水(w:v)以体积比为1:1.7的比例混合发酵，第0-3d分别接种解淀粉芽孢杆菌JY06和突变株JY06-E6，控温10-20℃，发酵第7d接种终浓度为10⁷CFU/mL的鲁氏酵母，发酵第14d再接种鲁氏酵母至在酱醅中的终浓度为10⁷CFU/mL，30℃恒温发酵，第90d结束发酵。

表2压榨后原油中精氨酸代谢相关氨基酸含量

注：1为不添加JY06；2为第0～3d添加10⁷CFU/mL～10⁸CFU/mL的JY06；3为第0～3d添加10⁷CFU/mL～10⁸CFU/mL的JY06-E6。

表2数据表明，第0～3d分别添加了10⁷CFU/mL～10⁸CFU/mL解淀粉芽孢杆菌JY06和突变株JY06-E6的酱油样品中，都能通过精氨酸脱亚胺酶代谢途径将精氨酸大量转化为鸟氨酸。并且第0～3d添加了10⁷CFU/mL～10⁸CFU/mL突变株JY06-E6的酱油样品中瓜氨酸的含量最低，与添加了初始菌株JY06的酱油样品相比，瓜氨酸含量降低了14.6％，氨基甲酸乙酯的含量降低了13.1％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。