本发明属于药物分子模型构建技术领域，具体涉及一种基于icam-1信号通路的高通量药物筛选模型的建立方法。
背景技术：
炎症是机体对各种致炎因素及其所产生损伤的防御反应,但过度的炎症反应也会对机体造成损伤(kleimana和tuckermannjp，2007；cohenj，2002)。目前临床上常用的抗炎药主要有两类:非甾体抗炎药和甾体类抗炎药。虽然这两类抗炎药都有一定的临床抗炎效果,但长期大量使用也会产生一系列不良反应,如胃粘膜、肝脏、肾脏损害等。天然药物具有来源广、造价低、副作用小等特点,随着对天然药物研究的不断深入,部分天然药物的抗炎作用已经得到认可，寻找低毒高效的新型天然抗炎药物是当前的研究热点之一。
酵母表面双杂交系统，是通过分泌途径来分析蛋白互作的一个平台，这种系统是在酵母表面展示系统的基础上发展起来的，优点在于无需蛋白表达纯化，在酵母体内同时表达这两个蛋白并最终展示于酵母表面。在ysd基础上酵母表面展示一个外源蛋白x，另一个蛋白y则以分泌的形式表达，如果x能结合y，那么y则可以与x一起附于酵母表面，利用y或与y融合的寡肽的抗体来检测他们的亲和性，并且x和y之间的亲和性可以通过流式细胞仪定量(hu,.etal.,2009)。这种技术的创新性在于：①首创gall和gall0启动子的联用。②建立利用酵母蛋白分泌途径的蛋白-蛋白相互作用体系。③本系统无需蛋白纯化即可进行蛋白的定向进化以及文库受体筛选。
icam-1与其受体lfa-1是免疫系统的重要成员。icam-1是免疫系统炎症反应的重要分子基础，属于免疫球蛋白超级家族成员之一，蛋白分子量为90kda，含有5个免疫球蛋白超级家族结构域；icam-1通常仅低水平表达于内皮细胞或者其他类型细胞，而细胞因子以及活性氧等激发下通过pkc以及nf-kb等信号途径高水平表达(long,2011；rahman和fazal,2009)。淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocytefunctionassociatedantigen-1,lfa-1)属于整合素家族,整合素是一类重要的细胞黏附分子,是由α和β两个亚基通过非共价键组成的异源二聚体,整合素可以通过其胞内区与胞内的细胞骨架蛋白和信号分子结合,通过由内到外(inside-out)和由外到内(outside-in)双向传递跨膜信号(abramsp和marshjw，2010；zhuj,2007；arnaoutm,2005)。
lfa-1和icam-1可提供协同刺激信号促进淋巴细胞活化、增殖和分化，在t细胞和抗原呈递细胞(antigen-presentingcells,apc)的相互作用中,lfa-1与icam-1配接,直接参与启动免疫突触的形成。lfa-1与icam-1的相互作用也能介导一系列炎症反应。(lisbys1989)。白细胞的过度激活是炎症病理过程中的一个重要环节，而白细胞停滞并浸润式的血管外渗依赖于炎症部位白细胞和内皮细胞膜表面黏附因子的表达与功能。icam一1作为免疫调节因子,通过受配体lfa-1的相互作用，介导白细胞不同亚群间的接触和黏附，调节白细胞的功能活性和免疫反应。中性粒细胞的吞噬作用、t淋巴细胞的识别抗原及活化、靶细胞的杀伤、t淋巴细胞对b淋巴细胞的激活及诱导分化、抗体形成等过程均与之有关系(gemmelle等1994)。近年来对基因调控的深入研究证实，肿瘤的发生是由众多基因参与的信号传导过程，其中细胞黏附分子介导的细胞间相互作用对于肿瘤的形成和转移至关重要，恶性肿瘤细胞表达不同的黏附分子，黏附机制的失调在肿瘤的发生和转移中起重要的作用(徐斌等，2001)。icam-1在一类高侵袭性乳腺癌细胞中高水平表达而成为分子标记(guo等,2014)。肺癌中icam-1也因为高水平表达而成为癌症诊断评估的重要手段(kotteas等,2014)。icam-1在急性排斥反应中起着重要的介导作用，肾移植术后，sicam-1在血和尿中的含量呈规律性变化(teppoam，2001；erikssonbm等，2001)，icam-1还介导apc与抗原特异性t细胞的相互作用以及细胞毒性t细胞和靶细胞的相互作用,其表达水平一般与肝细胞损伤程度呈正比(marteliust等，2000)在冠状动脉病变进展阶段,在血清中可检测到icam-1水平增高(luhh等，2010)。糖尿病模型中icam-1在大脑内皮细胞和表层神经原的表达量都增加(jing等,2014)。总之，icam-1在促进炎症部位的黏连性，控制肿瘤恶化和转移以及调节机体免疫反应中起重要作用。
白细胞通过整合素精细调控与icam-1的相互作用实现免疫信号传递。整合素是含有α和β两个亚基的复杂蛋白体；野生型整合素在细胞表面活性低，受到激发后构象发生变化(或称allostery)，与受体亲和力提高，实现信号传递。lfa-1l亚基的插入结构域(inserteddomain,idomain)介导与受体icam-1结合，其自身也存在构象变化(图2；luo等,2007)。为克服蛋白构象瞬息变化带来的研究困难，科学家通过各种手段锁定与受体高亲和结合的idomain突变体。利用酵母展示技术筛选到比野生型亲和性高20万倍的lfa-1突变体(jin等,2006)。这些突变体的筛选能够为药物精确释放等应用打下了坚实的基础(kang等,2011)。
icam-1在炎症以及各类疾病中的重要角色，使其成为重要药物开发靶点。icam-1单克隆抗体14c11能够抑制人鼻病毒侵染引起的肺部炎症恶化(traub等,2013)。lfa-1αlidomain与icam-1亲和力强而且分子量小，因此lfa-1也是药物靶点。lfa-1适宜作为白血病治疗靶标以及药物释放载体(phongpradist等,2010)。从化合物文库筛选到抑制lfa-1和icam-1结合的小分子也有药物开发潜力(kollmann等,2014)。
抑制icam-1相关信号途径也是药物开发重点。研究表明，抑制脑内皮细胞icam-1信号传递途径的药物在实验动物尚有效干预了脑内炎症的发展(turowski等，2005)。靶向tnf核酸反义抑制的纳米颗粒能有效抑制肠道炎症(wilson等,2010)。抑制pkc的药物能改善2型糖尿病的不良症状，减轻炎症因子表达等(farese等,2014)。一些中药成分也通过icam-1相关的细胞因子、黏附分子以及nf-kb途径而发挥作用(李姗姗和朱英,2012)。以上例证表明，icma-1及其关联的信号途径的众多蛋白都是潜在药物靶点。
技术实现要素：
申请人利用jing(jinm,songg,carmancv,etal.directedevolutiontoprobeproteinallosteryandintegrinidomainsof200,000-foldhigheraffinity[j].proceedingsofthenationalacademyofsciences,2006,103(15):5758-5763.)筛选到的人lfa-1αlidomain的高亲和突变体(f265s/f292g)、不亲合性突变体(d137a)以及野生型(wt)基因，提供一种基于icam-1信号通路的高通量药物筛选模型的建立方法，以icam-1表达量为靶点，构建高效哺乳动物细胞药物筛选模型。在该模型的构建方法中，申请人以工程化酵母为桥梁，一方面使酵母细胞表面携带人lfa-1αlidomain突变体，主导与icam-1高亲和结合；另一方面，在酵母胞内表达绿色荧光蛋白(gfp)，利用其荧光判断与一定哺乳动物细胞结合的酵母数量，从而评估动物细胞icam-1表达丰度。由于药物处理可能会引起不同疾病细胞模型icam-1表达量变化，因此借助工程酵母与哺乳动物细胞之间的直观结合可判断药物对icam-1信号途径的影响，达到药物筛选的目的。本发明构建的高通量药物筛选模型可塑性高，可根据不同疾病类型动物细胞建立各自相应药物筛选平台。
上述目的通过以下技术方案实现：
一种基于icam-1信号通路的高通量药物筛选模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)工程化酵母的构建和验证：在启动子gal10的后面依次连接分泌信号肽ss、α-半乳糖苷酶aga2基因、人lfa-1αlidomain基因和flag标签，使人lfa-1αlidomain胞外域、flag标签和α半乳糖苷酶aga2基因的n端到c端区域同时展示于eby100酵母细胞的表面；在启动子gal1的后面依次连接有gfp荧光蛋白基因和myc标签，使其能够在酵母细胞的胞内表达gfp绿色荧光蛋白，用于指示酵母数量，得到双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pdv3-intre-huαlidwt-wgfp，pdv3-intre-huαlidd137a-wgfp和pdv3-intre-huαlidf265s/f292g-wgfp；
所述的启动子gal10的核苷酸序列如seqidno：5所示；所述的分泌信号肽ss的核苷酸序列如seqidno：7所示；所述的α-半乳糖苷酶aga2基因的核苷酸序列如seqidno：8所示；
所述的人lfa-1αlidomain基因为三个，即wt、d137a、f265s/f267g，其中wt的核苷酸序列如seqidno：2所示，d137a的核苷酸序列如seqidno：3所示；f265s/f267g的核苷酸序列如seqidno：4所示；所述的flag标签的核苷酸序列如seqidno：9所示；所述的启动子gal1的核苷酸序列如seqidno：6所示；所述的gfp荧光蛋白基因的核苷酸序列如seqidno：1所示；所述的myc标签的核苷酸序列如seqidno：10所示；所述的双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pdv3-intre-huαlidwt-wgfp的核苷酸序列如seqidno：12所示；pdv3-intre-huαlidd137a-wgfp的核苷酸序列如seqidno：13所示；pdv3-intre-huαlidf265s/f292g-wgfp的核苷酸序列如seqidno：14所示；将所述的三个双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pdv3-intre-huαlidwt-wgfp、pdv3-intre-huαlidd137a-wgfp和pdv3-intre-huαlidf265s/f292g-wgfp以peg/liac方法和一个质粒载体对应一个酵母细胞方式分别导入酵母细胞eby100中，得到三个重组酵母细胞，培养这三个重组酵母细胞并诱导表达，得到表面展示有目标蛋白的酵母细胞后，用流式细胞仪检测人lfa-1αlidomain和gfp荧光蛋白是否表达；
(2)哺乳动物细胞炎症模型的构建和验证：将人微血管内皮细胞hmec-1接种到细胞培养板中，待细胞长至80％时经细菌脂多糖(lps)诱导3h后，用qrt-pcr方法检测icam-1基因的表达量；诱导12h后用抗icam-1单克隆抗体lb-2通过流式细胞仪检测icam-1蛋白的表达量；同时用1μm的雷公藤红素处理3h后，再经lps诱导3h后用qrt-pcr检测炎症因子基因mcp-1、icam-1、vcam-1和e-selectin的表达量，诱导12h后用抗icam-1单克隆抗体lb-2通过流式细胞仪检测icam-1蛋白的表达量；
(3)高通量药物筛选模型的构建和验证：以1um雷公藤红素作为抗炎活性检测的阳性药物，将hmec-1细胞接种到细胞培养板中，当hmec-1细胞生长至80％时，加入1μm雷公藤红素处理3h，加入1ug/ml的lps，诱导12h后，加入适量的表达lfa-1hualidomain蛋白和gfp蛋白的eby100酵母细胞，在室温下于120rpm/h动态结合1h，用ph为7.4的缓冲溶液b洗涤3遍后，在光学显微镜下观察每个处理组的酵母细胞数，在荧光显微镜下观察每个处理组eby100酵母细胞与hmec-1细胞的结合情况；用酶标仪统计每孔荧光强度；用1μm的地塞米松、100μg/ml的氢化可的松并参照上述雷公藤红素的处理步骤再处理一遍；以未经lps处理的hmec-1细胞与wt、d137a不敏感型酵母细胞为对照。
本发明的具体技术方案如下所述：
1、工程化酵母的构建和验证按以下步骤：
(1)在ys2h载体启动子gal1之后的ecori和bamhi酶切位点间插入wgfp基因，构建得到载体pdv3-intre-wgfp；在上述载体基础上，在ncoi和sali酶切位点间插入人lfa-1αlidomain基因(wt、f265s/f292g、d137a)，得到三个双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pdv3-intre-huαlid-wgfp，分别为pdv3-intre-huαlidwt-wgfp、pdv3-intre-huαlidd137a-wgfp、pdv3-intre-huαlidf265s/f292g-wgfp；wgfp基因从自有载体pctcon-wgfp扩增；wt从自有载体pctcon-huαlidwt扩增；f265s/f292g、d137a通过pcr引物在载体pctcon-huαlidwt定点突变获得，将所得载体进行测序验证。
(2)将构建得到的编码wgfp和人lfa-1αlidomain基因的双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pdv3-intre-huαlidwt-wgfp、pdv3-intre-huαlidd137a-wgfp和pdv3-intre-huαlidf265s/f292g-wgfp以peg/liac方法和一个质粒载体对应一个酵母细胞方式分别导入酵母细胞eby100中，得到重组酵母细胞；将重组酵母细胞涂在sdcaa固体培养板上，于30℃培养48h-60h后长出单克隆酵母，挑取单克隆酵母细胞先用2mlsdcaa液体培养基在30℃摇床中培养24h后，然后离心，再用2ml的sgcaa培养基在30℃摇床中培养24h诱导蛋白的表达，得到表达目标蛋白的酵母细胞；取3uμl酵母细胞用100ul缓冲液a(配方：ph＝7.4pbs+0.5％bsa+1mmmgcl2)洗涤一遍,然后用20μl冰浴冷却的含有小鼠抗flag抗体的缓冲液a标记，并在30℃温育30min，用100μl缓冲液aph7.4洗涤一遍，用20μll冰浴冷却的含有藻红蛋白标记的山羊抗小鼠igg抗体的缓冲液a标记一抗，在4℃孵育10min，用100μl缓冲液a洗涤一遍；洗涤后，将酵母细胞重悬在200μl的缓冲液a(ph7.4)中并用流式细胞仪检测小鼠lfa-1αlidomain和gfp荧光蛋白是否表达。
2、哺乳动物细胞炎症模型的构建以及验证按以下步骤：
(1)将hmec-1细胞(美国康奈尔大学jing馈赠)接种到24孔细胞培养板中，37℃、5％co2、100％湿度中培养，当细胞长至80％时，加入1μg/ml的lps分别处理0h、3h、6h、12h、18h、24h后提取rna，通过逆转录和qrt-pcr方法检测icam-1基因表达量；同时也用抗icam-1单克隆抗体lb-2(美国圣克鲁斯生物技术公司))通过流式细胞仪检测icam-1蛋白的表达量。
(2)将hmec-1细胞接种到24孔板中，在37℃、5％co2、100％湿度中培养，细胞长至80％时，加入1um的雷公藤红素处理3h，再加入1ug/ml的lps处理3h后提取rna，通过逆转录和qrt-pcr方法检测炎症因子mcp-1(ncbi登陆号nm_002982)、icam-1(ncbi登陆号nm_000201)、vcam-1(ncbi登陆号nm_001078)和e-selectin(ncbi登陆号nm_000450)基因的表达量，同时也利用抗icam-1单克隆抗体lb-2通过流式细胞仪检测icam-1蛋白的表达量。
3、高通量药物筛选模型的构建及验证按以下步骤：
(1)将hmec-1细胞接种到24孔板中，待细胞长至80％时，加入1μm的雷公藤红素处理3h，再加入1μg/ml的lps处理12h，用缓冲液b(成分：1×pbs、0.5％bsa、10mmmgcl2、ph＝7.4)洗涤一遍。取表达lfa-1hualidomain和gfp蛋白的eby100酵母细胞，离心，去上清，加入缓冲液b重悬浮洗涤，再离心、去上清，再加入缓冲液b重悬浮，每孔加入酵母细胞50μl，然后加缓冲液b补充至500μl。对照组用野生型(wt)、高亲和性(f265s/f292g)以及不亲合性突变体(d137a)的表达lfa-1hualidomain蛋白和gfp蛋白的eby100酵母细胞。在室温于120rpm震荡动态吸附1h，用缓冲液b在330rpm震荡洗脱3次，每次洗脱15min，最后在光学显微镜下拍照、计数以及在荧光显微镜下拍照。
(2)将hmec-1细胞接种到96孔细胞培养板中，待细胞长至80％时，加入1μm的雷公藤红素处理3h，再加入1μg/ml的lps处理12h，，用缓冲液b洗涤一遍；取表达lfa-1hualidomain和gfp蛋白的eby100酵母细胞，离心，去上清，加入缓冲液b重悬浮洗涤，再离心、去上清，加入缓冲液a重悬浮，每孔加入酵母细胞母液5μl，补充缓冲液b至100μl。在室温于120rpm震荡动态吸附1h；用缓冲液b在330rpm震荡洗脱3次，每次洗脱15min；在光栅酶标仪470nm/540nm波长下检测每孔的荧光值。用1μm的地塞米松、100μg/ml的氢化可的松并参照上述雷公藤红素的处理步骤再处理一遍。以dv3载体表达不相关蛋白的酵母细胞为阴性对照组，以表达野生型wt、高亲和性f265s/f292g和不亲合性突变体d137a的lfa-1hualidomain蛋白和gfp蛋白的eby100酵母细胞为对照组。
附图说明
序列表seqidno：1是本发明涉及的wgfp序列。序列长度为699bp。
序列表seqidno：2是本发明涉及的人lfa-1alidomain的wt序列。序列长度为570bp。
序列表seqidno：3是本发明涉及的人lfa-1alidomain的d137a序列。序列长度为570bp。
序列表seqidno：4是本发明涉及的人lfa-1alidomain的f265s/f292g序列。序列长度为570bp。
序列表seqidno：5是本发明涉及的启动子gal10序列。序列长度为9bp。
序列表seqidno：6是本发明涉及的启动子gal1序列。序列长度为9bp。
序列表seqidno：7是本发明涉及的分泌信号肽ss序列。序列长度为54bp。
序列表seqidno：8是本发明涉及的α半乳糖苷酶aga2基因序列。序列长度为207bp。
序列表seqidno：9本发明涉及的flag标签序列序列。序列长度为24bp。
序列表seqidno：10是本发明涉及的myc标签标签序列。序列长度为30bp。
序列表seqidno：11是本发明涉及的载体pdv3-intre-wgfp序列。序列长度为7143bp。
序列表seqidno：12是本发明涉及的载体pdv3-intra-huαlidwt-wgfp序列。序列长度为7713bp。
序列表seqidno：13是本发明涉及的载体pdv3-intra-huαlidd137a-wgfp序列。序列长度为7713bp。
序列表seqidno：14是本发明涉及的载体pdv3-intra-huαlidf265s/f292g-wgfp序列。序列长度为7713bp。
图1：本发明双通道蛋白表达载体构建以及验证技术路线图。
图2：工程酵母炎症药物筛选模型示意图。附图标记说明：
图2中的a图是在96孔细胞培养板中培养哺乳动物贴壁细胞至80％；图2中的b图是加入不同浓度的药物处理3h。图2中的c图是加入lps处理12h，诱导icam-1蛋白的表达，如果药物有抗炎效果，其icam-1表达量下降；图2中的d图是加入细胞表面展示人laf-1idomain，胞内表达gfp蛋白的工程酵母，在室温结合1h；图2中的e图是用ph＝7.4的缓冲溶液b(pbs,0.5％bsa,10mmmgcl2)洗涤3次；图2中的f图在酶标仪上读取每孔荧光值，如果样品荧光值低，表明药物影响炎症信号通路。
图3：双通道蛋白表达工程酵母的技术路线示意图。附图标记说明：图3中的a图是工程酵母载体构建图；图3中的b图的上图是工程酵母双向启动子蛋白表达结构图；图3中的b图的下图是idomain通过胞外分泌途径而转运至细胞表面以及gfp细胞质表达的示意图。
图4：本发明所用的载体和所构建载体示意图。附图标记说明：图4中的a图是载体pctcon-wgfp结构示意图；图4中的b图是载体ys2h结构示意图；图4中的c图是载体pctcon-huαlidwt结构示意图；图4中的d图是载体pdv3-intre-wgfp结构示意图；图4中的e图是载体pdv3-intra-huαlidwt-wgfp结构示意图；图4中的f图是载体pdv3-intra-huαlidd137a-wgfp结构示意图；图4中的g图是载体pdv3-intra-huαlidf265s/f292g-wgfp结构示意图。
图5：双通道蛋白表达酵母gfp与idomain蛋白表达量的流式细胞检测结果图谱。
附图标记说明：图5中的a图是pdv3-intra-huαlidwt–wgfp载体酵母的gfp蛋白表达；图5中的b图是pdv3-intra-huαlidd137a–wgfp载体酵母的gfp蛋白表达；图5中的c图是pdv3-intra-huαlidf265s/f292g–wgfp载体酵母的gfp蛋白表达；图5中的d图是pdv3-intra-huαlidwt–wgfp载体酵母的idomain蛋白表达；图5中的e图是pdv3-intra-huαlidd137a–wgfp载体酵母的idomain蛋白表达；图5中的f图是pdv3-intra-huαlidf265s/f292g–wgfp载体酵母的idomain蛋白表达。
将构建好的各载体转入酵母后，经诱导蛋白表达后，用流式细胞仪分析，携带gfp的各个酵母菌株的荧光强度(图中灰色阴影部分表示)以及以免疫标记flag标签指示的各酵母idomain表达量(图中灰色阴影部分表示)，图中黑线表示对照细胞，数值为实验酵母细胞高于对照酵母细胞的酵母细胞数量占总细胞的百分比。
图6：lps诱导hmec-1细胞不同时间icam-1表达图谱。附图标记说明：
图6中的a图是lps诱导hmec-1细胞不同时间icam-1基因表达水平；图6中的b图是lps诱导hmec-1细胞不同时间icam-1蛋白表达水平。*表示95％显著性差异。
图7：雷公藤红素处理hmec-1细胞icam-1的表达图谱。附图标记说明：
图7中的a图分别标示未诱导炎症(mock)、诱导炎症(lps)以及雷公藤红素处理并诱导炎症(celastrol+lps)下hmec-1细胞mcp-1、e-selectin、icam-1和vcam-1基因的表达水平；图7中的b图分别标示未诱导炎症(mock)、诱导炎症(lps)以及雷公藤红素处理并诱导炎症(celastrol+lps)下hmec-1细胞icam-1蛋白的表达水平。*表示95％显著性差异。
图8：工程酵母与hmec-1细胞结合的光学显微镜分析图谱。附图标记说明：图8中的a图分别表示三种分别表达人源wt、d137a、ha(f265s/f292g)的lfa-1蛋白idomain)的酵母各自与未诱导炎症(mock)、诱导炎症(lps)以及雷公藤红素处理并lps诱导炎症(celastrol+lps)的hmec-1细胞结合的光学显微镜下观察的结果(标记线长5mm)；图8中的b图表示单位面积下不同处理结合的酵母数量。*表示95％显著性差异。
图9：工程酵母与hmec-1细胞结合的荧光分析图谱。附图标记说明：图9中的a图表示三种分别表达人源wt、d137a、ha的lfa-1蛋白idomain的不同酵母各自与未诱导炎症(mock组)、诱导炎症(lps组)以及雷公藤红素处理并lps诱导炎症(celastrol+lps组)下hmec-1细胞结合的荧光显微镜下观察的结果；图9中的b图表示在酶标仪下检测工程酵母与hmec-1结合后荧光值。*表示95％显著性差异。
图10：利用其他阳性药物处理后工程酵母与hmec-1细胞结合的酶标仪检测荧光值结果图谱。
具体实施方式
实施例1：工程化酵母的质粒载体构建
(1)以自有的质粒pctcon-wgfp为模板，用带酶切位点接头的引物wgfp(5’－atcgaattctacttcatacattttcaaattaagatggctagcgtgagcaagggcgaggag－3’，序列特异引物外加ecori位点)和wgfp(5’－gttcggatccagtgatcccggcggcgttc－3’，序列特异引物外加bamhi位点)扩增出wgfp片段(720bp)。pcr反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，54℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。将所扩增的wgfp基因pcr产物插入ys2h载体启动子gal1之后的ecori和bamhi酶切位点之间，筛选阳性克隆并测序，获得基因wgfp，我们将这个质粒命名为pdv3-intra-wgfp
(2)在上述pdv3-intra-wgfp载体基础上，申请人在ncoi和sali酶切位点间插入人lfa-1αlidomain基因(wt、d137a、f265s/f292g)。wt从载体pctcon-hualidwt扩增；d137a以pctcon-hualidwt为模板，通过pcr引物(d137a①(5’－ttctgctagcaacgtagacctggtatttctgtttgctggttcgatgagcttgcag－3’)和d137a②(5’－gttcggatccagtcaggtcctgtttgcttg－3’)使第26号碱基a突变为c即使天冬氨酸(d)突变为甘氨酸(a)定点突变获得；f265s/f292g以pctcon-hualidwt为模板，通过pcr引物f265s/f292g①(5’－ttctgctagcaacgtagacctggtatttct－3’)、f265s/f292g②(5’－cttctcacctgtgtccagaattttcacaaac－3’)、f265s/f292g③(5’－ttctggacacaggtgagaagctgaaagatctattc－3’)、f265s/f292g④(5’－gttcggatccagtcaggtcctgtttgcttg－3’使第409、410碱基tt突变为ag即使苯丙氨酸(f)突变为丝氨酸(s)和第491号碱基c突变为g即丙氨酸(a)突变为甘氨酸(g))定点突变获得。
wt基因是通过带酶切位点接头的引物wt(5’－agtcccatggatgcaggtcctgtttgctt－3’，序列特异引物外加ncoi位点)和wt(5’－ccgcgtcgacaacgtagacctggtatttctg－3’，序列特异引物外加sali位点)从载体pctcon-hualidwt扩增出wt片段(570bp)。pcr反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。将扩增的获得的pcr产物连接到pdv3-intra-wgfp载体筛选阳性克隆并测序，获得基因wt，申请人将载体质粒命名为pdv3-intra-huαlidwt-wgfp。
(3)d137a基因的制备：通过带酶切位点接头的引物d137a①(5’－ttctgctagcaacgtagacctggtatttctgtttgctggttcgatgagcttgcag－3’，序列特异引物外加nhei位点)和d137a②(5’－gttcggatccagtcaggtcctgtttgcttg－3’，序列特异引物外加bamhi位点)从载体pctcon-hualidwt扩增出基因片段d137apcr①。pcr反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，52℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。然后以基因片段d137apcr①为模板，通过用带酶切位点接头的引物d137a③(5’－agtcccatggatgcaggtcctgtttgctt－3’，序列特异引物外加ncoi位点)和d137a④(5’－ccgcgtcgacaacgtagacctggtatttctg－3’，序列特异引物外加sali位点)扩增出d13a基因(570bp)。pcr反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。将扩增的获得的pcr产物连接到载体pdv3-intra-wgfp，筛选阳性克隆并测序，获得基因d137a将所得的载体质粒命名为pdv3-intra-huαlidd137a-wgfp
(4)f265s/f292g基因的制备：，以pcr引物定点突变构建，以载体pctcon-hualidwt为模板。用引物f265s/f292g①(5’－ttctgctagcaacgtagacctggtatttct－3’，在该序列的特异引物外加nhei位点)和f265s/f292g②(5’－cttctcacctgtgtccagaattttcacaaac－3’)、f265s/f292g③(5’－ttctggacacaggtgagaagctgaaagatctattc－3’)和f265s/f292g④(5’－gttcggatccagtcaggtcctgtttgcttg－3’，序列特异引物外加bamhi位点)从自有载体pctcon-hualidwt分别扩增出中间基因片段f265s/f292gpcr①和f265s/f292gcr②。
pcr反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，52℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃延伸10min。然后以基因片段f265s/f292gpcr①和f265s/f292gpcr②为模板，通过用带酶切位点接头的引物f265s/f292g⑤(5’－agtcccatggatgcaggtcctgtttgctt－3’，序列特异引物外加ncoi位点)和f265s/f292g⑥(5’－ccgcgtcgacaacgtagacctggtatttctg－3’，序列特异引物外加sali位点)扩增出f265s/f292g基因片段(570bp)，。pcr反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。将扩增的获得的pcr产物连接到pdv3-intra-wgfp载体，筛选阳性克隆并测序，获得基因f265s/f292g(570bp)，该载体质粒命名为pdv3-intra-huαlidf265s/f292g-wgfp
实施例2：工程化酵母载体的导入酵母及诱导蛋白的表达
将上述编码wgfp和lfa-1αlidomain基因(序列见seqidno：1和seqidno：2、3、4、5)的三个双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pdv3-intre-huαlidwt-wgfp、pdv3-intre-huαlidd137a-wgfp和pdv3-intre-huαlidf265s/f292g-wgfp以peg/liac方法(itoh,fukuday,muratak,etal.transformationofintactyeastcellstreatedwithalkalications[j].journalofbacteriology,1983,153(1):163-168.)和一个质粒载体对应一个酵母细胞方式分别导入酵母细胞eby100中，得到重组酵母细胞，培养该重组酵母细胞并诱导所述重组载体的表达(具体步骤按照：hux,kangs,chenx,etal.yeastsurfacetwo-hybridforquantitativeinvivodetectionofprotein-proteininteractionsviathesecretorypathway[j].journalofbiologicalchemistry,2009,284(24):16369-16376报道的方法)，得到所述表达有目标蛋白的酵母细胞。
具体步骤如下：
(1)将5μleby100酵母感受态细胞中加入20-100gpdv3-intra-muαlid-wgfp质粒，然后加入50μle23solution溶液(购自美国zymoresearch公司)彻底混均；
(2)在30℃培养箱中孵育45min，在孵育期间，震荡混均2-3次；
(3)将上述所述的混合物涂在sdcaa固体培养板上，在30℃培养箱中培养48-60h。
(4)试管中加入2mlsdcaa培养基，接种在sdcaa培养板上长出来的单克隆酵母细胞，于30℃摇床中震荡培养24h后，离心，弃上清，加入2mlsgcaa培养基在30℃摇床中震荡培养24h诱导蛋白表达。
实施例3：工程化酵母蛋白表达验证
重组酵母经诱导后可通过流式细胞仪分别检查idomain以及gfp的表达。idomain表达量以flag标签蛋白为对象，用流式细胞仪进行检测。具体步骤如下：
(1)吸3ul表达有wgfp和lfa-1αlidomain蛋白的酵母细胞加入96孔v型板中，取未表达蛋白的酵母做阴性对照，向每个孔中加100μl标记缓冲液aph＝7.4(配方：pbs+0.5％bsa+10mmmgcl2)，混匀后离心(4℃,3min，3000rpm)使细胞沉淀，去上清。吸净缓冲液a，每孔加20μl含10μg/ml的一抗即小鼠抗flag抗体(美国圣克鲁斯生物技术公司)缓冲液a，30℃振荡孵育30min。
(2)加入100μl缓冲液a洗涤酵母细胞，离心(4℃,3min，3000rpm)吸弃上清，然后加入20μl含二抗即山羊藻红蛋白共轭抗鼠抗体(美国圣克鲁斯生物技术公司)的缓冲液a于4℃孵育15min。
(3)加入100μl标记缓冲液a洗涤酵母细胞，离心(4℃,3min，3000rpm)吸弃上清，然后将酵母细胞用200μl缓冲液a重悬后即可用流式细胞仪检测。其结果如图5所示，idomain和gfp蛋白都高表达。
实施例4：哺乳动物细胞炎症模型的构建和基因验证
(1)hmec-1细胞培养如下：hmec-1细胞培养在mcdb131(购自美国sigma公司)培养基中，其中添加10％胎牛血清(fbs，购自浙江天杭生物科技有限公司)、双抗(100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)、1μg/ml的氢化可的松(生工生物工程(上海)股份有限公司)和10ng/ml人重组生长因子(hegf，生工生物工程(上海)股份有限公司)，于37℃、5％co2、100％湿度中培养。hmec细胞用1μg/ml的lps(escherichiacoli.055:b5,sigma)诱导。
(2)hmec-1细胞接种到24孔细胞板(美国corningincorporated)中，于37℃、5％co2、100％湿度中培养，待细胞长至80％时，加入1μg/ml的lps分别处理0h、3h、6h、12h、18h、24h后提通过取rna，逆转录和qrt-pcr方法检测icam-1基因的表达量。如图6中a图所示，相对0h，lps诱导3h和6h后hmec-1细胞icam-1基因高表达，超过6h后，icam-1基因表达下降，所以我们选取lps处理hnec-1细胞3h后检测炎症因子基因的表达量。
(3)hmec-1细胞接种到24孔细胞培养板中，于37℃、5％co2、100％中培养，待细胞长到80％时，加入1μm的雷公藤红素处理3h，再加入1ug/ml的lps处理3h后通过提rna，逆转录，qrt-pcr方法检测炎症因子mcp-1(ncbi登陆号nm_002982)、icam-1(ncbi登陆号nm_000201)、vcam-1(ncbi登陆号nm_001078)和e-selectin(ncbi登陆号nm_000450)基因的表达量。如图7中的a图所示，于未诱导(nolps)相比1ug/ml的lps诱导3h后炎症因子mcp-1、icam-1、vcam-1和e-selectin基因的都高表达，同时与lps诱导相比1μum的雷公藤红素(celastrol)处理后炎症基因表达都下降，说明lps诱导hmec-1细胞能够作为炎症模型以及雷公藤红素可以作为抗炎活性阳性药物。
(4)用trizol试剂提取总rna，将24孔细胞培养板中上清吸弃，用pbs洗涤一遍，每孔分别加入200mltrizol(美国invitrogen公司)试剂裂解10min，均质裂解混合物转移到1.5ml离心管，加入40μl氯仿上下颠倒30次混均后室温静置5min，4℃，12,000×g离心15min，收集上层无色水相溶液200μl于新的1.5ml离心管，并加入80μl异丙醇上下颠倒20次混均室温静置10min，将混合溶液转移到rna吸附柱中，4℃，8,000×g离心1min，rna吸附柱中加入750μl75％浓度的乙醇溶液，4℃，8,000×g离心1min，洗涤两次，最后4℃，8,000×g空离1min。加30μl的无rnase水(超纯，北京康为世纪生物科技有限公司)到rna吸附柱中，于65℃温浴5min溶解后，12,000×g离心2min收集rna溶液并测浓度。取500ng的总rna用逆转录试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)按照说明书在pcr仪上热循环仪(基因扩增pcr系统a100，杭州朗基科学仪器有限公司)进行反转录，反转录条件：42℃2min，42℃15min，和85℃5min。取2μl的cdna产物用于实时定量基因扩增分析。预混2xqpcr试剂盒(sybrgreen2xmastermix，北京康为世纪生物科技有限公司)用于扩增特定基因的定量pcr，qrt-pcr条件：95℃预变性10min；95℃10sec，60℃25sec，72℃25sec，40个循环。用于扩增特定基因的定量pcr以atp5j(ncbi登录号为nm_001003703)为内参，引物通过nationalinstituteofhealthqprimerdepot网站(http://primerdepot.nci.nih.gov/)设计，使用登陆号nm_000201(icam-1)、nm_001078(vcam-1)、nm_002982、(mcp-1)、nm_000450(e-selectin)和nm_001003703(atp5j)。
实施例5：哺乳动物细胞炎症模型的构建和蛋白验证
hmec-1细胞用细菌脂多糖(lps)诱导后，用抗icam-1抗体lb-2通过流式细胞仪检测hmec-1细胞经lps不同时间诱导以及1μm的雷公藤红素处理3h再经lps诱导后icam-1蛋白的表达量，具体操作方法参照报道的方法(kangs,parkt,chenx,etal.tunablephysiologicinteractionsofadhesionmoleculesforinflamedcell-selectivedrugdelivery[j].biomaterials,2011,32(13):3487-3498.)。
(1)将hmec-1细胞接种到24孔细胞培养板中，于37℃、5％co2、100％湿度中培养，待细胞长至80％时，加入1μg/ml的lps分别处理0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、24h、30h、36h后用胰酶消化，并用抗icam-1抗体lb-2通过流式细胞仪检测hmec-1细胞icam-1蛋白的表达量。如图6b所示，hmec-1细胞经1μg/ml的lps诱导3h后icam-1蛋白已经表达，12h后icam-1蛋白表达达到最高并保持稳定，所以我们选取lps诱导12h后检测icam-1蛋白表达。
(2)将hmec-1细胞接种到24孔板中，于37℃、5％co2、100％湿度中培养，待细胞长到80％时，加入1μm的雷公藤红素处理3h，再加入1μg/ml的lps处理12h或24h后用胰酶消化，并用抗icam-1抗体lb-2通过流式细胞仪检测hmec-1细胞icam-1蛋白的表达量。如图7中的b图所示，与未诱导(不加lps组)相比1ug/ml的lps诱导12h或24h后icam-1蛋白高表达，同时与lps诱导相比1μum的雷公藤红素处理2h后icam-1蛋白表达下降，说明lps诱导hmec-1细胞能够作为炎症模型以及雷公藤红素可以作为抗炎活性阳性药物。
(3)用抗icam-1抗体lb-2通过流式细胞仪检测icam-1蛋白的表达量。将24孔细胞培养板中上清吸弃，用pbs洗涤一遍，加入50ul的0.25％胰酶(含0.5mmedta)在37℃培养箱中消化3min，加入150μl的mcdb131培养基，震荡3min，转移到96孔v形板(美国corningincorporated)中，离心(4℃,3min，3000rpm)使细胞沉淀，吸弃上清，向每个孔中加100μl的ph＝7.4的缓冲液a(pbs+0.5％bsa+1mmmgcl2)洗涤一遍，在4℃，3000rpm离心,3min，吸净缓冲液a，每孔加入100μl的含有5％的牛血清蛋白的pbs溶液，在室温下于120rpm震荡封闭30min，在4℃，3000rpm，离心3min，吸弃上清，加入20μl含5μg/ml的一抗即抗-icam-1抗体lb-2的缓冲液a，在室温于120rpm震荡孵育1h，用不加抗icam-1抗体lb-2的缓冲液a做阴性对照。加入100μl缓冲液a洗涤细胞，离心(4℃,3min，3000rpm)吸弃上清，再加入20μl含二抗即山羊藻红蛋白共轭抗鼠抗体的缓冲液a于4℃孵育15min。加入100μl缓冲液a洗涤细胞，离心(4℃,3min，3000rpm)吸弃上清，然后将细胞在200μl缓冲液a中重悬后即可用流式细胞仪检测icam-1蛋白的表达量。
实施例6：高通量药物筛选模型的构建和验证
(1)将hmec-1细胞接种到24孔细胞培养板中，于37℃、5％co2、100％湿度中培养，待细胞长至80％时，加入1μm的雷公藤红素处理3h，再加入1μg/ml的lps处理12h后，用ph＝7.4的缓冲液b(1×pbs、0.5％bsa、10mmmgcl2)洗涤一遍。取表达lfa-1alidomain和gfp蛋白的eby100酵母细胞(wt、d137a、f265s/f292g)，离心，去上清，加入等体积的缓冲液b重悬浮洗涤，再离心、去上清，加入等体积的洗涤缓冲液b重新悬浮，每孔加入酵母细胞50ul，补充缓冲液b至500μl。在室温于130rpm震荡动态吸附1h，吸弃缓冲液b，加入500μl的缓冲液b于330rpm震荡洗脱3次，每次洗脱15min。最后加入300μl的缓冲液b在光学显微镜下拍照、计数以及在荧光显微镜下拍照。阴性对照组为pdv2载体的表达不相关蛋白的酵母细胞，对照组用表达wt、f265s/f292g以及d137a蛋白的酵母细胞。如图8中的a图所示，经lps诱导的hmec-1细胞与表达lfa-1alidomain的高亲和突变体f265s/f292g的酵母细胞结合多，其他不结合或结合很少，特别是雷公藤红素处理后即使再经lps诱导，hmec-1细胞与表达lfa-1alidomain的高亲和突变体f265s/f292g的酵母细胞结合也非常少；8b所示，是量化8a中单位面积的hmec-1细胞结合的酵母细胞数量；9a所示，在荧光显微镜下观察到经lps诱导的hmec-1细胞与表达lfa-1alidomain的高亲和突变体f265s/f292g的酵母细胞结合组能够观察到大量的绿色荧光说明酵母细胞结合多，其他基本观察不到荧光说明酵母不结合或结合很少，特别是雷公藤红素处理后即使再经lps诱导，hmec-1细胞与表达lfa-1alidomain的高亲和突变体f265s/f292g的酵母细胞结合组也只有少量绿色荧光说明酵母结合非常少。说明工程酵母与哺乳动物细胞之间的直观结合可判断药物对icam-1信号途径的影响，达到药物筛选的目的。
(2)将hmec-1细胞接种到96孔细胞培养板中，于37℃、5％co2、100％湿度中培养，待细胞长至80％时，加入1μm的雷公藤红素处理3h，再加入1μg/ml的lps处理12h后，用ph＝7.4的缓冲液b(1×pbs、0.5％bsa、10mmmgcl2)洗涤一遍。取表达lfa-1alidomain和gfp蛋白的eby100酵母细胞离心，去上清，加入等体积的缓冲液b重悬浮洗涤；再离心、去上清，加入等体积的缓冲液b重悬浮，每孔加入酵母细胞5μl，补充缓冲液b至100μl。在室温于130rpm震荡动态吸附1h，吸弃缓冲液b，加入200μl的缓冲液b于330rpm震荡洗脱3次，每次洗脱15min。最后加入100μl的缓冲液b在光栅酶标仪于激发波长/发射波长为470nm/540nm波长下检测每孔荧光值。阴性对照组为pdv2载体的表达不相关蛋白的酵母细胞，对照组用表达wt、f265s/f292g以及d137a蛋白的酵母细胞。如图8a所示，经lps诱导的hmec-1细胞与表达lfa-1alidomain的高亲和突变体f265s/f292g的酵母细胞结合组检测到高的的荧光值说明酵母细胞结合的多，其他检测到非常低或低的荧光值说明酵母不结合或结合很少，特别是雷公藤红素处理后即使再经lps诱导，hmec-1细胞与表达lfa-1alidomain的高亲和突变体f265s/f292g的酵母细胞结合组检测的荧光值与只用lps诱导的有显著差异。说明工程酵母与哺乳动物细胞之间的结合可以在96孔细胞培养板中进行，并且用光栅酶标仪就能够检测，具有简便、快速、大量的特点，达到高通量药物筛选的目的。
(3)将hmec-1细胞接种到96孔细胞培养板中，于37℃、5％co2、100％湿度中培养，待细胞长至80％时，加入1μm的地塞米松、100μg/ml的氢化可的松处理3h，再加入1μg/ml的lps处理12h后，用ph＝7.4的缓冲液b(1×pbs、0.5％bsa、10mmmgcl2)洗涤一遍。取表达lfa-1alidomain和gfp蛋白的eby100酵母细胞离心，去上清，加入等体积的缓冲液b重悬浮洗涤；再离心、去上清，加入等体积的缓冲液b重悬浮，每孔加入酵母细胞5μl，补充缓冲液b至100μl。在室温于130rpm震荡动态吸附1h，吸弃缓冲液b，加入200μl的缓冲液b于330rpm震荡洗脱3次，每次洗脱15min。最后加入100μl的缓冲液b用光栅酶标仪在激发波长/发射波长为470nm/540nm波长下检测每孔荧光值。阴性对照组为pdv2载体的表达不相关蛋白的酵母细胞，对照组用表达wt、f265s/f292g以及d137a蛋白的酵母细胞。如图10所示，经lps诱导的hmec-1细胞与表达lfa-1alidomain的高亲和突变体f265s/f292g的酵母细胞结合组检测到高的荧光值说明酵母细胞结合的多，其他检测到非常低或低的荧光值说明酵母细胞不结合或结合很少，特别是地塞米松或氢化可的松处理后即使再经lps诱导的hmec-1细胞与表达lfa-1alidomain的高亲和突变体f265s/f292g的酵母细胞结合组检测的荧光值与只用lps诱导组有显著差异。说明工程酵母与哺乳动物细胞之间的结合模型，也适合其他抗炎阳性药物被验证，具有稳定的特点。
主要术语的英文和中文对照：
(1)hmec-1(humanmicrovascularendothelialcells，人微血管内皮细胞)；
(2)lps((lipopolysaccharide，细菌脂多糖)；
(3)lfa-1(lymphocytefunction-associatedmolecule，淋巴细胞功能相关分子-1)
(4)icam-1(intercellularadhesionmolecule-1，细胞间黏附分子-1)；
(5)wt：人lfa-1αlidomain基因的野生型；
(6)d137a：人lfa-1αlidomain基因的高不亲和突变体d173a；
(7)f265s/292g为人lfa-1αlidomain基因的不亲和突变体f265s/292g；
主要溶液的配制：
(1)缓冲液a的配制：磷酸盐缓冲液(pbs)+0.5％牛血清白蛋白+1mmmgcl2；
(2)缓冲液b的配制：磷酸盐缓冲液(pbs)+0.5％牛血清白蛋白+10mmmgcl2；
(3)ph＝7.4磷酸盐缓冲液(pbs)，1x，1l的配制：
氯化钠8g；
氯化钾0.2g；
十二水合磷酸氢二钠3.63g；
磷酸二氢钠；0.2g
将以上成分逐一溶解，加ddh2o至1l。
(4)sdcaa固体培养基，1x，1l的配制：
a液：
将以上成分逐一溶解，加ddh2o至500ml，然后在121℃，100kpa下高压湿热灭菌30min。
b液
葡萄糖20g；
difcoyeastnitrogenbasew/oaminoacidsandammoniumsulfate(美国bd公司)6.7g；
bactocasaminoacids(美国bd公司)5g；
将以上试剂逐一溶解，加ddh2o至500ml，然后用孔径为0.22um的水系滤膜过滤灭菌；将a液和b液加在一起混均；
(5)sdcaa液体培养基(1x1l)配制：
a液：
十二水合磷酸氢二钠13.6g
二水合磷酸二氢钠9.68g
以上逐一溶解，加ddh2o至500ml，然后在121℃，100kpa下高压湿热灭菌30min。
葡萄糖20g；
difcoyeastnitrogenbasew/oaminoacidsandammoniumsulfate(美国bd公司)6.7g；
bactocasaminoacids(美国bd公司)5g；
将以上试剂逐一溶解，加ddh2o至500ml，然后用孔径为0.22um的水系滤膜过滤灭菌；将a液和b液加在一起混均。
(6)sgcaa液体培养基(1x1l)配制：
十二水合磷酸氢二钠13.6g；
二水合磷酸二氢钠9.68g；
以上逐一溶解，加ddh2o至500ml，然后121℃高压湿热灭菌100kpa，，30min。
半乳糖20g；
difcoyeastnitrogenbasew/oaminoacidsandammoniumsulfate(美国bd公司6.7g；
bactocasaminoacids(美国bd公司)5g；
将以上试剂逐一溶解，加ddh2o至500ml，然后用孔径为0.22um的水系滤膜过滤灭菌；将a液和b液混均。
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