一种比率型检测HSO4‑离子和SO2及其衍生物的双功能荧光分子探针的制作方法

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种比率型HSO₄^-和SO₂及其衍生物双功能荧光分子探针的合成，以及该探针在环境和细胞中区别检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物等方面的应用。

背景技术：

在多种重要的阴离子中，硫酸氢盐(HSO₄^-)因为其在生物学中重要作用而受到重视，这种两亲性阴离子在高pH下能解离产生有毒有腐蚀性的硫酸根阴离子(SO₄^2-)，对眼睛、皮肤、粘膜和上呼吸道具强烈刺激作用和腐蚀性(Spectrochimica Acta Part a-Molecular and Biomolecular Spectroscopy.2016. 169. 38-44)。而亚硫酸盐已广泛应用于食品和饮料加工作为防腐剂，因为它们具有抑制微生物生长和防止变色的能力。然而，过量的亚硫酸盐可以诱导腹泻，低血压，过敏反应和哮喘等疾病。此外，在现代工业过程中大量释放二氧化硫气体，这导致严重的环境问题；而且二氧化硫可溶于水生成亚硫酸盐和亚硫酸氢盐，对人体有毒害作用。因此，发展可靠有效的方法检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物是非常必要的。

近年来，由于荧光探针的高选择性和灵敏性以及能实时成像等优点，荧光探针作为优异的检测技术已经引起越来越多的关注，因其操作简单，灵敏度高，无毒和可视化的优点，荧光分子探针已成为在生命系统中可视化阴离子的强大工具，近年来在分析检测中应用非常广泛。在所报道的论文和专利中，对SO₂衍生物的检测方法居多(香豆素类亚硫酸氢根离子探针的合成及荧光性质研究,彭梦姣,郭媛.精细化工,2011.、中国专利CN 104804729 A、中国专利CN 104262287 A)，而专利报道检测HSO₄^-的方法却并不多见，如中国专利CN 102746452 A，但其合成步骤多，分离提纯困难，制备成本高。对于所报道的荧光分析方法中受浓度影响小，能有效消除微环境变化影响的比率型荧光探针则仅占少数，且检测HSO₄^-和SO₂及其衍生物要采用不同的分析方法，或采用不同的单功能荧光探针进行检测，多功能荧光探针是指利用一种荧光可以对不同的客体进行特异性识别，产生不同的荧光信号，截至目前多功能探针发展缓慢，鲜有报道，而基于同一探针比率型检测HSO₄^-和SO₂及其衍生物且互不干扰的双功能探针还未见报道。

技术实现要素：

鉴于上述情况，克服一些现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种比率型检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的双功能荧光分子探针，该比率型荧光探针能在同一检测条件下利用不同的反应机理和现象达到对HSO₄^-离子和SO₂其衍生物的分别检测。

本发明的目的还在于提供一种制备方法简单、高灵敏度、极低检测限和成本较低的上述荧光分子探针的合成与应用方法。

本发明解决问题采取的具体技术方案为，一种比率型检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的双功能荧光分子探针的合成和应用，其化学结构式如下：

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一种比率型检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的双功能荧光分子探针的合成和应用，所述的荧光分子探针的合成方法包括以下步骤：

步骤1. 合成3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓碘化物

a. 将1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚和碘乙烷溶解在乙腈中，加热搅拌回流反应20小时；

b. 将步骤a中反应液冷至室温，过滤，用乙醚洗涤滤饼，真空干燥，或将冷却液逐渐加入乙醚中，析出固体，过滤，用乙醚洗涤固体，真空干燥；得3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓碘化物；

步骤2. 合成3-乙基-2-(4-羟基苯乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓碘化物

. 将3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓碘化物和对羟基苯甲醛溶于无水乙醇中，加入催化量的哌啶或吡咯烷，室温搅拌反应8-12小时；

.将步骤中的反应液过滤，用乙醇洗涤，真空干燥得权利要求1所述的荧光分子探针。

本发明的荧光分子探针使用方法没有特殊限制，通常可以在室温下将探针分子溶解在有机相和水相体积比8:2的环境下测试，有机相为配置1 mM探针溶液的二甲基亚砜(DMSO)和检测时加入的乙醇，水相为HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物水溶液和检测时加入的去离子水。

本发明的一种比率型检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的双功能荧光分子探针的具体特征如下：该分子荧光探针用二甲基亚砜(DMSO)溶解，探针分子在有机相和水相(8:2，v/v)中时其最大紫外吸收波长在562 nm，当加入HSO₄^-后，探针分子产生一个在463 nm处的新的宽吸收峰，随着HSO₄^-浓度的增高，吸收逐渐增强，同时在562 nm处的吸收峰的逐渐下降；荧光发射光谱(激发波长为500 nm)变化情况为：545 nm处荧光强度逐渐增强，而580 nm处荧光强度逐渐下降，呈比率型变化，当激发波长为420 nm时，为单一的580 nm处荧光强度逐渐增强；两种激发波长呈现不一样的荧光性质，以比率型检测为佳，相应地，溶液的颜色由红色变为黄色，裸眼能够清楚的看到探针溶液颜色的明显变化。而探针溶液当加入检测物为SO₂及其衍生物以后，产生两个新的紫外吸收峰，最大紫外吸收波长为321 nm和263 nm，随着SO₃^2-浓度的增高，321 nm和263 nm处的吸收峰逐渐上升，而562 nm处的吸收峰逐渐下降，同时荧光发射光谱(激发波长为320 nm)中455 nm处荧光强度逐渐增强，探针溶液的颜色由红色逐渐变为无色。

上述荧光探针实现了在同一检测条件下利用不同的反应机理和荧光信号及不同的现象达到对HSO₄^-和SO₂的分别检测，互不干扰，对SO₄^2-, PO₄^3-, HPO₄^2-,H₂PO₄^-, NO₂^-, NO₃^-, Cl^-, Br^-, CO₃^2-, HCO₃^-, OH^-, Ac^-等阴离子无响应，即使在10 equiv.的干扰离子存在下探针对HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物都具有很好的响应，对检测物灵敏度高，HSO₄^-离子的检测限为1.39 nM，SO₂及其衍生物的检测限为2.82 nM，能够实现对HSO₄^-和SO₂的定量检测，而且探针的合成成本和检测成本较低，操作简单，利用同一探针不同机理、不同检测现象互不干扰分别检测HSO₄^-和SO₂的双功能荧光探针在生物化学、分析检测等领域都极具实用价值。

附图说明

图1为本发明的比率型检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的双功能荧光分子探针

紫外吸收光谱随加入不同浓度的HSO₄^-的变化情况，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。

图2为本发明的比率型检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的双功能荧光分子探针荧光发射光谱随加入不同浓度的HSO₄^-离子的变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度(激发波长为500 nm)。

图3为本发明的比率型检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的双功能荧光分子探针紫外吸收光谱随加入不同浓度的SO₂及其衍生物的变化情况，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。

图4为本发明的比率型检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的双功能荧光分子探针荧光发射光谱随加入不同浓度的SO₂及其衍生物的变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度(激发波长为320 nm)。

图5为本发明的比率型检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的双功能荧光分子探针与不同离子的荧光发射光谱变化情况，横坐标为不同的离子，纵坐标为荧光强度(激发波长为500 nm)。

图6为本发明的比率型检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的双功能荧光分子探针荧光发射光谱在其他竞争离子存在下加入SO₂(亚硫酸盐或亚硫酸氢盐)的变化情况，横坐标为不同的竞争离子，纵坐标为荧光强度(激发波长为320 nm)。

图7为本发明的比率型检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的双功能荧光分子探针的核磁氢谱图。

图8为本发明的比率型检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的双功能荧光分子探针检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的荧光对比图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的说明。

本发明所述的荧光分子探针的合成路线如下图所示：

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实施例1 合成3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓碘化物。

在100 mL圆底烧瓶中加入10 g(47.78 mmol)1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚和8.94 g(57.34 mmol)碘乙烷，40 mL乙腈，装上回流冷凝管，加热搅拌回流反应20小时；将反应液冷至室温，过滤，用乙醚洗涤滤饼，真空干燥得3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓碘化物14.6 g(产率为83.7%)。

实施例2 合成3-乙基-2-(4-羟基苯乙烯基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓碘化物

在25mL圆底烧瓶中加入3.0 g(8.21 mmol)3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓碘化物和1.2 g(9.86 mmol)对羟基苯甲醛溶于15 mL无水乙醇中，加入3-4滴哌啶或吡咯烷，室温搅拌反应12小时；将反应液过滤，用乙醇洗涤，真空干燥得本发明荧光分子探针化合物2.98 g(产率为77.2%)。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 8.55 - 8.43 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 8.43 - 8.37 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.31 - 8.25 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.24 - 8.18 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.18 - 8.12 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.11 - 8.03 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.83 – 7.76 (ddd, J = 8.4, 6.9, 1.3 Hz, 1H), 7.73 - 7.66 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.54 - 7.40 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 7.00 - 6.89 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.10 - 4.48 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.21 - 1.89 (s, 6H), 1.68 - 1.31 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。

实施例3 双功能探针在检测HSO₄^-离子中的应用。

本发明所述的荧光分子探针光谱性质实验：将探针溶解在二甲基亚砜(DMSO)中配置成1 mM的探针溶液，分别配置1mM的NaHSO₄水溶液和Na₂SO₃水溶液，以及10 mM的干扰离子水溶液，所有测试均在有机相和水相体积比8:2的室温环境下测试，有机相为配置1 mM探针溶液的二甲基亚砜(DMSO)和检测时加入的乙醇，水相为HSO₄^-和SO₂水溶液和检测时加入的去离子水。具体测试方式为：取20 μL 1 mM的探针溶液，1580 μL的分析纯无水乙醇，20 μL 1mM的NaHSO₄水溶液和380 μL的去离子水溶液于2 mL的样品管中，震荡摇匀即可测试其紫外吸收和荧光发射光谱变化情况，所有测试均保持有机相和水相的体积比为8:2(每一个测试样品总体积为2 mL)，例如当要求测试HSO₄^-浓度为50 μM时探针对HSO₄^-响应情况的紫外和荧光变化情况，配制样品情况为20 μL 1 mM的探针溶液，1580 μL的分析纯无水乙醇，100 μL 1 mM的NaHSO₄水溶液和300μL的去离子水溶液于2 mL的样品管中即可。图1表明随着HSO₄^-浓度的增加，探针溶液紫外吸收光谱发生明显蓝移99 nm；图2表明该双功能探针对检测HSO₄^-荧光呈比率型变化，探针溶液颜色由红色变为黄色，检测机理为HSO₄^-阴离子诱导的H聚集旋转移位；图5干扰性实验表明：探针溶液只对HSO₄^-有很好的响应，对SO₄^2-, PO₄^3-, HPO₄^2-,H₂PO₄^-, NO₂^-, NO₃^-, Cl^-, Br^-, CO₃^2-, HCO₃^-, OH^-, Ac^-等阴离子无响应。

实施例4双功能探针在检测SO₂及其衍生物中的应用。

所有测试条件与实施例3一致，取20 μL 1 mM的探针溶液，1580 μL的分析纯无水乙醇，20 μL 1 mM的Na₂SO₃或NaHSO₃水溶液和380 μL的去离子水溶液于2 mL的样品管中，震荡摇匀即可测试其紫外吸收和荧光发射光谱变化情况，图3表明随着Na₂SO₃或NaHSO₃浓度的增加，紫外吸收光谱发生明显变化，产生了两个新的吸收峰，且荧光明显增强(图4)，探针溶液颜色由红色逐渐变为无色，检测机理为SO₂及其衍生物与探针选择性地亲核加成；与检测HSO₄^-离子的现象完全不同，从而实现利用同一探针对不同检测物的不同机理分别检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物；图6表明干扰离子SO₄^2-, PO₄^3-, HPO₄^2-,H₂PO₄^-, NO₂^-, NO₃^-, Cl^-, Br^-, CO₃^2-, HCO₃^-, OH^-, Ac^-等阴离子存在条件下，该探针依然对SO₂及其衍生物有很好的响应。

本发明的比率型检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的双功能荧光分子探针的合成和应用，基于同一探针、不同机理、不同检测现象互不干扰地分别检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的双功能荧光探针尚属首例报道，在生物化学、分析检测等领域极具实用价值。同时为今后双功能乃至多功能荧光探针的发展提供了一些思路。尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细的介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，具有本文所述技术特征的一种比率型检测HSO₄^-离子和SO₂及其衍生物的双功能荧光分子探针的合成和应用，均落入本专利的保护范围。