森林山蛭抗血栓肽Sylvestin及其基因和应用的制作方法

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种森林山蛭(haemadipsasylvestris)抗血栓肽sylvestin及其基因和应用。

背景技术：

脑血管疾病是导致我国中老年人死亡的主要病因之一，也是世界性卫生战略研究重点之一。在脑血管疾病中，急性缺血性疾病的发病率居于首位，具有致残率高、死亡率高和复发率高的特点。全球脑卒中病死逾150万例/年，随着老年人口的增加呈逐年增长的趋势，严重威胁着人类生命健康和生活质量。因此，研究治疗急性脑缺血的药物具有巨大的社会需求和重要的社会意义。

急性脑缺血的主要病因是脑血管栓塞，这是由于脑血管中血栓形成导致血流不畅，进而造成血管梗死的结果。治疗急性脑缺血的关键措施之一是解除血管栓塞，恢复缺血区血液供应。因此，溶栓治疗成为临床治疗急性脑缺血的关键环节。溶栓药物的应用被临床证明能有效解除脑缺血，成为治疗急性脑缺血的主要方向。目前被美国fda批准的抗脑缺血药物只有t-pa(组织型纤溶酶原激活物)一种，但该药仅在发病3h有效。t-pa的作用靶点是纤溶酶原，会导致较高的出血发生率。以fxiia(激活型凝血酶原十二因子)和kallikrein(激肽释放酶)为作用靶点的药物出血倾向非常低，因此以它们为作用靶点，研究和开发新型药效好、副作用低的治疗抗血栓药物，具有良好的社会经济效益和市场前景。

蛭类是我国的一种传统中药，两千多年前的《神农本草经》中就有描述。《本草纲目》谓其：“咸走血，苦胜血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝经血分药，故能通肝经聚血。”中医认为水蛭是一种传统的破血药，有逐瘀、通经脉、利水道的功效，主要用于治疗血瘀经闭、中风偏瘫、跌打损伤等疾病。2005年，欧洲正式批准蛭类疗法为合法的治疗手段。每年仅在德国就有35万条水蛭用于医疗。

森林山蛭(haemadipsasylvestris)，又称草蛭。蛭纲,水蛭科。体略呈长椭圆形，长约3厘米。该物种的模式产地在缅甸长林山。分布于印度尼西亚、缅甸、印度、越南以及中国大陆的云南等地。主要栖息于潮湿的山区草地或竹林里以及水附近或水中。当人畜经过时，就附着吸食血液。山蛭能分泌抗凝血的物质，破坏凝血功能。因此被山蛭咬过的伤口常流血不止。民间也利用这一性质，用山蛭来治疗病人的局部血流不畅。我们首次从森林山蛭中识别了一个作用很强的fxiia和kallikrein抑制剂sylvestin。

本发明涉及的多肽sylvestin能够抑制血栓形成。通过动物模型证实它具有很强的抗血栓和抑制急性脑缺血活性。发明人将本发明的森林山蛭抗血栓肽sylvestin全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的森林山蛭抗血栓肽sylvestin编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。

技术实现要素：

本发明的目的是基于上述理论研究和现有技术基础，提供一种新的具有强烈的抗血栓性的森林山蛭sylvestin肽及其基因和应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

森林山蛭抗血栓肽sylvestin是森林山蛭抗血栓肽基因编码的一种单链多肽，分子量4790.5道尔顿，森林山蛭抗血栓肽sylvestin的氨基酸序列(seqidno:1)为：tsepvcacpkmlfwvcgkdgetythpciakchnvevehdgkck。

森林山蛭抗血栓肽基因的克隆包括:

森林山蛭唾液腺总rna提取，mrna纯化，mrna反转录及cdna文库构建，设计引物，利用pcr方法筛选森林山蛭抗血栓肽基因。扩增引物长度为20个核苷酸，其序列为5’aaacctcggaaccggtatgt3’，pcr另一扩增引物为3’pcrprimer引物，其序列为5’ccgaggtttggtggctcatt3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码森林山蛭抗血栓肽的由316个核苷酸组成，自5’端至3’端序列(核苷酸序列seqidno:2)为:

gggaacccgaaacgggcattcgagctcggtacccggggatcctctagagattaaacctcggaaccggtatgtgcatgcccaaaaatgctattttgggtttgtggtaaagatggtgagacttacacccatccttgcattgcaaaatgccataatgttgaagttgaacatgatgggaagtgcaaatgaaagggaccattcttcgaaattgcctgaaacttaaaaatattgatttgaatttaattaattcttattaattataacgtttcatcataataaatgaattacgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

其中55-183的片段编码森林山蛭抗血栓肽成熟肽。森林山蛭抗血栓肽基因作为基因工程制备森林山蛭抗血栓肽的应用。

森林山蛭抗血栓肽的分离纯化方法：

收集的森林山蛭匀浆液首先过凝胶层析柱sephadexg-50，收集具有抗血栓活性的峰，冻干，过反向高压液相(rp-hplc)c4、c18柱，纯化得到森林山蛭抗血栓肽。

森林山蛭抗血栓肽的化学合成方法：

根据edman降解法测得序列和编码森林山蛭抗血栓肽肽基因推断的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433a,appliedbiosystems)合成其全序列。通过hplc反向柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)测定其分子量。合成的抗血栓肽溶于灭菌水，用于活性测定。

一种药物组合物，该药物包括：

a.权利要求1所述的抗血栓肽sylvestin或药学上能接受的盐；

b.药学上能接受的载体或赋形剂。

本发明的有益效果在于:

分离纯化得到森林山蛭抗血栓肽sylvestin，并克隆得到其cdna序列。该抗血栓肽能够抑制fxiia、kallikrein，有极显著的抗血栓和抑制急性脑缺血作用。另外该抗血栓肽具有结构简单、人工合成方便、抗血栓活性强，能作为抑制fxiia、kallikrein的试剂和制备抗血栓、抗急性脑出血药物中的应用。

附图说明

图1显示森林山蛭抗血栓肽sylvestin的抗血栓作用。

图2显示森林山蛭抗血栓肽sylvestin的抗急性脑缺血作用。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

森林山蛭抗血栓肽基因克隆：

1.森林山蛭总rna提取：

(1)迅速从液氮中取出多条山蛭，用剪刀剪下山蛭前端(包括山蛭口腔和咽部)，总重量100mg左右，放入研钵中，加入液氮后充分研磨。待研成粉末状后，加入1mltrizol提取缓冲液(invitrogen)，与液氮共研磨。待trizol溶化，将研钵中全部液体吸出至1.5ml离心管中，室温放置5min。

(2)加入200μl氯仿，剧烈震荡混匀15s，室温放置5min；4℃，12000g离心10min；吸取上层无色水相至新的1.5ml离心管中(尽量多吸上层液体，但一定要避免吸到中下层，中层白色为蛋白沉淀，粉红色下层为酚-氯仿)。

(3)加入等体积4℃预冷异丙醇，颠倒混匀，室温放置15min，4℃，12000g离心10min，管底微量沉淀为rna，用移液枪轻微吸去上清。

(4)沉淀加入1ml75％冰上预冷乙醇洗涤，4℃，7500g离心5min，弃上清，重复两次；超净台中放置5-10min，晾干(无乙醇味)，即为森林山蛭头部总rna；往晾干的ep管中加入30μl0.1％depc水，轻微震荡溶解rna。从中吸取2μl加98μldepc水，于230nm、260nm、280nm波长处检其吸光值。取10μl用于1％琼脂糖胶电泳。其余总rna于-80℃冻存。

2.森林山蛭cdna双链的合成：

按照creator^tmsmart^tmcdnalibraryconstructionkit(clontech)说明书操作构建森林山蛭头部cdna文库。具体操作如下：

(1)cdna第一链合成(mrna反转录)

在无rnasepcr管中加入2μl森林山蛭头部总rna、1μlsmart^tmⅳoligonucleotide、1μlcdsⅲ/3’primer，加1μldepc水使总体积达到5μl，混匀并离心10s；72℃保温2min，冰上孵育2min；在上述pcr管中加入2μl5×第一链buffer、1μl20mmdtt、1μl10mmdntp混合物、1μlpowerscript逆转录酶，混匀并离心10s。pcr仪中42℃保温1h，冰上终止反应。(2)采用长末端聚合酶链式反应(ld-pcr)方法扩增cdna第二链

将1μlcdna第一链(mrna反转录)，40μl去离子水，5μl10×buffer缓冲，1μl50×dntp混合物，1μl5’pcrprimer，1μlcdsⅲ/3’pcr引物以及1μl聚合酶于pcr管中混匀。按以下程序进行pcr扩增：

①95℃1min

②20个循环：

95℃15sec

65℃30sec

68℃6min

扩增结束后，合成好的cdna双链用pcr管分装成10μl每管，取出5μl进行1％琼脂糖电泳，其余立刻置于-80℃保存。

3.大肠杆菌dh5α感受态细胞的制备：

(1)挑取单个dh5α菌落，接种于1ml不含氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于1mllb培养液中，37℃振荡2h。

(2)当od600达到0.35时，将菌液在冰上放置10min使培养物冷却至0℃。

(3)4℃，5000rpm离心5min，以回收细胞。

(4)倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。

(5)每1ml初始培养液加入600μl预冷的0.1mcacl2-mgcl2溶液(80mmmgcl2,20mmcacl2)重悬每份细胞沉淀。

(6)4℃，5000rpm离心5min，以回收细胞。

(7)倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量液体流尽。

(8)每1ml初始培养物加入60μl用冰预冷的0.1mcacl2重悬细胞沉淀。4℃冰箱放置10-18h。

4.cdna文库的筛选：

(1)特异性引物的合成

使用primerblast设计两条引物。

(2)从山蛭cdna中克隆目标序列

20μl体系：tag酶0.1μl，cdsiii、smart4各0.4μl，dntp0.4μl，buffer2μl，mg²⁺1.2μl，pcr水16μl

(3)序列的连接、转化与检测。在微量离心管中加入0.2μltakarapmd19-t载体，2.3μldna双链；加入2.5μl等量的连接酶缓冲液混合物(冰上溶解)；16℃反应过夜；全部5μl连接产物加至60μldh5α感受态细胞中，冰上放置30min；42℃热激90s，轻放于冰上3-5min,修复细胞膜；尽快加入温浴过的lb培养基，37℃，80rpm摇菌45min；取100μl涂布与含有100ug/ml的amplb培养基中，37℃培养16h；菌落长出后，挑单克隆进行10μl菌液pcr。

5.挑取单克隆测序及序列筛选：

挑取20个与目标序列核酸大小相近的单菌落送测序公司进行dna测序。采用abi3730测序仪测序。测序引物为m13(+)：5’-cgccagggttttcccagtcacgac-3’,m13(-):5’-gagcggataacaatttcacacagg-3’。测序结果进行序列筛选。

6.森林山蛭抗血栓肽sylvestin基因序列测定：

提取质粒dna用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国appliedbiosystems373a全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为bcabest^tmsequencingprimerrv-m和bcabest^tmsequencingprimerm13-47，bcabest^tmsequencingprimerrv-m序列：5`gagcggataacaatttcacacagg3’，bcabest^tmsequencingprimerm13-47：5’cgccagggttttcccagtcacgac3’。基因测序结果自5’端至3’端序列(核苷酸序列seqidno:2)为:

gggaacccgaaacgggcattcgagctcggtacccggggatcctctagagattaaacctcggaaccggtatgtgcatgcccaaaaatgctattttgggtttgtggtaaagatggtgagacttacacccatccttgcattgcaaaatgccataatgttgaagttgaacatgatgggaagtgcaaatgaaagggaccattcttcgaaattgcctgaaacttaaaaatattgatttgaatttaattaattcttattaattataacgtttcatcataataaatgaattacgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

森林山蛭抗血栓肽sylvestin基因核苷酸的序列表为：序列长度为316个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cdna，来源：森林山蛭唾液腺。

编码森林山蛭成熟抗血栓肽sylvestin的为核苷酸序列seqidno:2的第55-183位核苷酸。森林山蛭抗血栓肽sylvestin的氨基酸序列(seqidno:1)为:tsepvcacpkmlfwvcgkdgetythpciakchnvevehdgkck。

森林山蛭抗血栓肽sylvestin基因作为基因工程制备森林山蛭抗血栓肽的应用。

森林山蛭抗血栓肽sylvestin分离纯化：

1.山蛭的处理

用液氮直接速冻活的森林山蛭。在低温下，用棉布包裹山蛭并用铁锤把山蛭敲成数段。把敲过的山蛭和适量的50mmtris(ph8.0)缓冲溶液混合匀浆，4℃，12000g离心30min，上清即为森林山蛭体腔液粗样。把全部上清混合在一起，分装成3ml每管，于-80℃保存。

2.山蛭sephadexg-50凝胶分离与反相高压色谱分离

第一步sephadexg-50凝胶层析。取2ml山蛭匀浆液上样于tris-hcl(0.02mol/l，ph7.8)缓冲液平衡过的sephadexg-50(amershambioscience)凝胶柱(26mm×100cm)。用同样浓度的平衡缓冲液洗脱，流速为0.3ml/min，3ml/管，使用cbs-a程控全自动部分收集器收集(上海青浦沪西仪器厂)。使用μltrospec2100pro分光光度计(amershambiosciences)测定280nm和215nm值。收集各峰组分存于-20℃备用。

第二步c4反向高压色谱法。活性蛋白使用反相高压色谱(waters1525binaryhplcpump)c4柱(lichrospher10×250mm)继续分离；溶剂a：0.1％tfa的超纯水溶液，溶剂b：0.1％tfa的乙腈溶液。洗脱使用线性浓度梯度：0-10min，b：0％；10-11min，b：0-5％；11-40min，b：5-33％；40-50min，b：33-38％；50-60min，b：38-70％,60-70，b：70-100％。流速为1.5ml/min，上样量为3mg粗样蛋白。峰收集使用waters2489可见/紫外检测器检测(215nm)，每一个峰为一个收集单位。

第三步c8柱反向高压色谱法。c8柱(xbridge^tm4.6×250mm)。溶剂a：0.1％tfa的超纯水溶液，溶剂b：0.1％tfa的乙腈溶液。洗脱使用线性浓度梯度：0-10min，b：0％；10-14min，b：0-20％；14-24min，b：20％；24-55min，b：20-35％；55-60min，b：35-100％。流速为0.7ml/min，上样量为1mg粗样蛋白。峰收集使用waters2489可见/紫外检测器检测(215nm)，每一个峰为一个收集单位。以上步骤跟踪检测和收集fxiia和kallikrein抑制活性部分。edman讲解法对其纯化所得的抗血栓肽纯品进行n-端测序(model491,abi,美国)。电喷雾电离质谱(esi-ms)测定抗血栓肽分子量。

森林山蛭抗血栓肽sylvestin的化学合成：

1.森林山蛭抗血栓肽sylvestin的化学合成方法：根据编码森林山蛭抗血栓肽sylvestin的蛋白测序结果和基因推断森林山蛭抗血栓肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过hplc反相c18柱层析脱盐、纯化。

2.分子量测定采用快原子轰击质谱法(fastatombombardmentmassspectrometry,fab-ms)，以甘油:间硝基苄醇:二甲亚砜(1:1:l，v:v:v，体积比)为底物，cs⁺作为轰击粒子，电流为1μa，发射电压为25kv。

3.纯化的森林山蛭抗血栓肽用高效液相色谱hplc方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

森林山蛭抗血栓肽sylvestin是森林山蛭抗血栓肽基因编码的一种单链多肽，分子量4790.5道尔顿，等电点6.28。森林山蛭抗血栓肽sylvestin的氨基酸序列(seqidno:1)为：tsepvcacpkmlfwvcgkdgetythpciakchnvevehdgkck。

森林山蛭抗血栓肽sylvestin的药理实验：

1.酶动力学：在96孔板中10μl样品与10μl终浓度为0.2μm的fxiia混合于40μl缓冲液(100mmnacl、50mmtris-hcl(ph8.0)、5mmcacl2)中。室温放置5分钟后，加入30μl缓冲液与10μl终浓度为0.04mm发色底物的混合液，终体积为100μl。凝血反应的动力学使用epoch(biotek)酶标仪、genchs1.09软件检测od405，20min，间隔47s。样品浓度为10μm。sylvestin对凝血酶、fxa等无抑制作用。可以抑制fxiia和kallikrein。经计算sylvestin对fxiia和kallikrein的抑制常数分别为2.9μm、17.8nm。

2.aptt和pt实验：将aptt试剂平衡至室温，轻轻倒置混匀aptt试剂。50μlaptt试剂、50μl正常血浆和5μl样品混匀后，在37℃的水浴锅中孵育3分钟，加入50μl预热的cacl2溶液，立即混匀，用酶标仪记检测od650。pt实验：37℃预热凝血酶原试剂15分钟。50μl正常血浆与5μl样品在37℃水浴锅中孵育3分钟，加入预热的凝血酶原试剂100μl，立即混匀，用酶标仪记录od650。sylvestin对pt实验无作用，对aptt实验具有浓度依赖效果，表明sylvestin抑制内源性凝血途径，与是fxiia抑制剂的结果一致。

3.卡拉胶致鼠尾血栓模型：实验动物用昆明小鼠，体重25-30g(昆明医学院实验动物中心提供)，饲养一周后，随机分组(n＝6)，雌雄各半。第1组为生理盐水对照组，样品组为2mg/kg、4mg/kg，阳性对照为500u/只肝素钠(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)。尾静脉给药处理30min后，以60mg/kg的剂量从小鼠腹腔注射卡拉胶(carrageenan，typei，sigma，用生理盐水溶解成1％的浓度)，由于在低温环境下，血栓形成率>90％，所以饲养温度为17.5℃。12、24、36、48h后根据尾部皮肤颜色变化测定血栓形成的平均长度。随着时间的增加，各组血栓的平均长度都增加了。12h由于血栓形成的不明显，测量时有较大的误差，但对照组明显比其他组症状明显；肝素钠从12h到24h长度增加了一倍；对照组基本不变，可能因为限于鼠尾的长度；样品组长度略微增加。在每个测量时间点，相对于对照组，4mg/kg和肝素对鼠尾血栓形成的影响都有意义。数据处理为graphpadprime5，数据平均值±sd，t-test(*p<0.05)。在12h到36h，sylvestin组对血栓的抑制率都降低了，然而在48h抑制率有升高了，不过整体上随着时间的延长，抑制率降低了。相对于肝素组和2mg/kg组，4mg/kg组抑制率变化不大。sylvestin对血栓的抑制率随着浓度的增加变大(图1)。

4.急性脑缺血线栓模型：使用2％戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉昆明小鼠(30～35g)，中深度麻醉后，颈正中切口逐层切开大鼠皮肤及皮下组织，分离胸锁乳突肌，切断二腹肌前腹，暴露右侧颈总动脉(cca)，颈内动脉(ica)和颈外动脉(eca)，使用电凝器凝结eca上甲状腺动脉和咽动脉并剪断。结扎eca的远心端，并在其近心端挂线，暂时夹闭cca和ica，剪断eca,将线栓从eca残端插入ica，结扎eca残端，移除ica的动脉夹，由ica向内上方缓慢推进。适当调整方向，插入到线栓标记处(从cca分叉处计算10mm)，开始计时，1h后移去线栓，观察无活动性出血后缝合切口。整个过程用电热毯保温，温度为36～37℃。将苏醒后的动物放回笼内，使其自由饮食。脑缺血24h，按bedersonscore评分法评估并记录神经功能缺损评分：0分为无功能障碍；1分为不能伸展右前肢；2分为向右侧旋转；3分为向右倾倒；4分为无自主活动伴意识障碍；5分为死亡。24h后麻醉剪下头部，取出脑组织，置于脑模具中(冰上)，沿视交叉向后切成2mm厚的切片，将其放入2％ttc的磷酸盐缓冲液，于37℃温箱中染色30min，再用4％多聚甲醛过夜固定并拍照。缺血体积百分数＝[缺血体积-(左半脑体积-右半脑体积)]/右半脑体积×100。缺血再灌注前10min，尾静脉给药1次，实验组分别为1、3、5mg/kg，对照组为生理盐水，体积100μl。缺血再灌注后10min内，尾静脉给药1次，剂量同上；6h再给药一次。每组6只。sylvestin可以有效减轻脑缺血再灌注造成的损伤(图2)。

综上所述，森林山蛭抗血栓肽sylvestin，能用于制备fxiia和kallikrein抑制剂和抗血栓、抗急性脑出血药物中的应用。

一种药物组合物，该药物包括：

a.权利要求1所述的抗血栓肽sylvestin或药学上能接受的盐；

b.药学上能接受的载体或赋形剂。

其中，本发明多肽可以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲璜酸、乙璜酸、苯璜酸或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

药物组合物还包括药学上能接受的载体。术语“药学上能接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。所述的载体包括(但不限于)：盐水、缓冲剂、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。这些载体还可能存在辅助性的物质，如润湿剂、乳化剂、ph缓冲剂等。

所述的赋形剂指：在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。

sequencelisting

<110>中国科学院昆明动物研究所

<120>森林山蛭抗血栓肽sylvestin及其基因和应用

<130>sylvestin

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>43

<212>prt

<213>haemadipsasylvestris

<220>

<221>sylvestin-protein

<222>(1)..(43)

<400>1

thrsergluprovalcysalacysprolysmetleuphetrpval

151015

cysglylysaspglygluthrtyrthrhisprocysilealalys

16202530

cyshisasnvalgluvalgluhisaspglylyscyslys

313540

<210>2

<211>316

<212>dna

<213>haemadipsasylvestris

<220>

<221>sylvestin-conding-dna

<222>(55)..(183)

<400>1

gggaacccgaaacgggcattcgagctcggtacccggggatcctctagagattaaacctcg60

gaaccggtatgtgcatgcccaaaaatgctattttgggtttgtggtaaagatggtgagact120

tacacccatccttgcattgcaaaatgccataatgttgaagttgaacatgatgggaagtgc180

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