沼水蛙皮肤丝氨酸蛋白酶抑制肽及其基因和制药应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种沼水蛙皮肤丝氨酸蛋白酶抑制肽及其应用。

背景技术：
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丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,serpin)的最基本功能是防止蛋白质水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。通过对丝氨酸蛋白酶的调节，丝氨酸蛋白酶抑制剂对生物体内的生理生化功能都有重要的影响。如，它们在血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成及转运、细胞内蛋白质水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等方面都有重要作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂调节如此众多的生理过程导致它们有广泛的临床应用价值，如，抑酶肽aprotinin除在临床上广泛用于胃炎、胰腺炎等疾病的治疗外，也在胸外科手术中用于抗纤溶、抑制接触性激活、抗炎症等(Br J Anaesth.2013,110(5):675-8)。丝氨酸蛋白酶类似物如Kallikrein、tryptase在风湿性关节炎以及鼻炎、结膜炎、哮喘、胃肠炎、心血管系统炎症等炎症发生中起着重要的作用(Biol Chem.2004,385(11):989-96)。因此，丝氨酸蛋白酶抑制剂已成为国际研究的热点，其研究与开发则蕴含着巨大的临床治疗药物的制备价值。

两栖动物一直以来都是传统药物的源泉。中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylax nigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctis limnocharis)等两栖类动物被作为中国的传统中药材而被广泛的应用。现代研究表明：这些两栖动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性，如，广谱抗菌作用、抗肿瘤、局部麻醉、镇痛、免疫调节、对心血管系统的作用等(Dongwuxue Yanjiu,2015,36(4):183-222)。传统中药药物成分的复杂性及其炮制方法的局限性造成药物活性成分不能更好发挥作用，从这些传统药物中寻找特定的活性单体化合物是中药现代化的重要内容之一。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已经成为新药发明的热点。目前有许多分子量小于10kDa的蛋白酶抑制剂多肽已经从两栖动物皮肤中被鉴定。这些两栖动物皮肤的蛋白酶抑制剂除在前体蛋白的加工和降解过程中有作用外，还在抗微生物感染中有功能，因此许多来自两栖动物的蛋白酶抑制剂同时具有抗菌和蛋白酶抑制剂活性，这些多肽包括ranacyclin-B、KPHTI、HV-BBI、HJTI、hylaserpin S2、OGTI、PYR、PSKP-1、PSKP-2、BOTI、BVTI、BMTI、BPTI、pLR和BSTI等(Chem Rev.2015,115(4):1760-1846)。

肿瘤是危害人类健康的一类主要疾病，而且治疗药物匮乏。据报道，恶性肿瘤仅在我国每年就新增加160万病例，而且患病年龄逐渐年轻化。目前在化疗中所使用的药物，如阿霉素、环磷酰胺、肿瘤坏死因子等均具有较大的人体毒性，副作用非常大，因而肿瘤治疗药物的开发是药物研制的热点。目前从两栖动物皮肤中发现一些带有抗肿瘤活性的多肽，这些多肽大部分是抗菌肽，如，magainins、aureins、citropins、brevinin-1、ranatuerin-2、temporin和dermaseptin等(Chem Rev.2015,115(4):1760-1846)。丝氨酸蛋白酶除直接杀死肿瘤细胞外，还能通过其他机制发挥抗肿瘤作用，如丝氨酸蛋白酶抑制剂maspin在体内和体外对肿瘤都有明显的抑制作用，其作用机理在于抑制肿瘤细胞浸润和血管形成(Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets.2013,13(2):123-32)。

我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质研究不多。沼水蛙(hylarana guentherip)主要分布于我国中南部各省、台湾、海南岛和香港，是我国特色资源动物之一。

进入21世纪以来，基因组学的飞速发展及合成生物学的兴起大大促进了天然产物的结构与功能研究；本发明利用转录组学方法和药理学研究获得沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽的全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。

技术实现要素：
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本发明的目的是基于上述技术背景，提供种新的具有广谱抗微生物、丝氨酸蛋白酶抑制活性和促胰岛素分泌作用的沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽及其基因和它作为制备病原微生物感染性疾病、糖尿病和肿瘤性疾病治疗药物的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽，所述的沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽由24个氨基酸组成的环肽，分子量2725.12道尔顿，等电点10.232，其氨基酸序列为：Gly Lys Cys Asn Leu Leu Cys Lys Val Lys Asn Lys Ile Lys Asn Lys Val Lys Ala Ile Leu Gln Lys Leu(GKCNLLCKVKNKIKNKVKAILQKL)(SEQ ID NO.1)，上述多肽第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸相成分子内二硫键。

所述沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽的编码基因由438个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为其序列为(SEQ ID NO.4)：

序列中第364-435位核苷酸编码具有功能的成熟沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽。

所述沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽可在制备病原微生物感染性疾病、糖尿病和肿瘤性疾病治疗药物应用。

本发明的有益效果在于:

由沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽编码基因推导其氨基酸结构，合成的沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽具有显著的抑制细菌、真菌，丝氨酸蛋白酶抑制剂活性和促胰岛素分泌作用。该沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽具有结构简单、人工合成方便、功能多样的有益特点。

附图说明：

图1为本发明沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽HPLC纯化鉴定结果；

图2为本发明沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽质谱鉴定结果；

图3为本发明沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽的抑制丝氨酸蛋白酶活性结果；

图4为本发明沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽促胰岛素释放活性结果。

具体实施方式：

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽，所述的沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽由24个氨基酸组成的环肽，分子量2725.12道尔顿，等电点10.232，其氨基酸序列为：Gly Lys Cys Asn Leu Leu Cys Lys Val Lys Asn Lys Ile Lys Asn Lys Val Lys Ala Ile Leu Gln Lys Leu(GKCNLLCKVKNKIKNKVKAILQKL)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸相成分子内二硫键。

所述沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽的基因序列SEQ ID NO.4的第364-435位核苷酸编码。本发明的沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽及其基因的制备过程包括如下步骤：

实施例1，沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽基因克隆：

I、沼水蛙皮肤总RNA提取：活体沼水蛙用水清洗干净，放入液氮中速冻4h，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入10m1总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司产品)，于20m1玻璃匀浆器中匀浆30min。加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10min，4℃，12000rpm离心10min，弃除沉淀。向上清中加入等体积的异丙醇，室温放置10min，4℃，12000rpm离心10min，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底的沉淀物即为沼水蛙皮肤总RNA。

II、沼水蛙皮肤mRNA的纯化：沼水蛙皮肤mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的mRNA Isolation Systems试剂盒。具体如下：取沼水蛙皮肤总RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10min，加人3μl Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30S，弃上清，加0.5×SSC 0.3m1，至磁力架吸附30S，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30sec，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.L ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30sec，将上清移至新的试管，再加入0.15m1DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30S，移上清至上述试管，则上清中为纯化的沼水蛙皮肤mRNA。加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中得到沼水蛙皮肤mRNA。

III、沼水蛙皮肤cDNA文库构建：采用CLONTECH公司Creator^TM SMART^TM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。

A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：在0.5ml无菌的离心管加入1μl沼水蛙皮肤mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。混匀离心管中的试剂并以12000rpm离心15sec，72℃保温2min。将离心管在冰上孵育2min。在离心管中加入以下试剂2.0μl 5×第一链缓冲、1.0μl 20mM二硫苏糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反转录酶。混合离心管中试剂并以12000rpm离心15sec，在42℃保温1h。将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链：95℃预热PCR仪。将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2PCR缓冲、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。在PCR仪中按以下程序扩增：95℃20sec，95℃5sec，68℃6min，22个循环。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。

C.PCR产物用PROMEGA公司的SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒进行抽提回收，步骤如下：将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。以12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液。加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，以12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液。重复步骤上述步骤。12000rpm离心5min。将离心纯化柱置于新的离心管中。加入30μl超纯水，在室温下静置5min。以12000rpm离心30sec，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。

D.酶切、连接以及连接产物的转化：在微量离心管中加入1μl Takara pMD18-T载体、4μl沼水蛙cDNA双链溶液，全量为5μl。加入5μl的连接酶缓冲混合物。16℃反应2h。全量(10μl)加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30min。42℃加热90Sec后，再在冰中放置1分钟。加入37℃孵育过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60min。取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16h，形成单菌落。每个LB平皿用5m1LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含1×10⁶个单独克隆。

Ⅳ、沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽基因克隆筛选：扩增引物长度为25个核苷酸，其序列为5’ATGAAGACCTGGCAGTGTGTGCTATGG 3’(SEQ ID NO.2)，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMART^TM cDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列为5’ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3’(SEQ ID NO.3)。PCR反应在如下条件下进行：94℃30sec，50℃45sec和72℃2.5min，35个循环。

首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μ1),37℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。

Ⅴ、沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽基因序列测定和结果：提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国Applied Biosystems 373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M和BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47，BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M序列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’(SEQ ID NO.5)，BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’(SEQ ID NO.6)。基因测序结果自5’端至3’端序列为(SEQ ID NO.4):

沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽基因核苷酸的序列表为：序列长度为438个碱基；序列类型：核酸；链数：单链；拓扑学：直链状；序列种类：cDNA；来源：沼水蛙皮肤。

根据沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽的基因推断编码由功能的成熟活丝氨酸蛋白酶抑制肽为第364-435位核苷酸，氨基酸序列为：Gly Lys Cys Asn Leu Leu Cys Lys Val Lys Asn Lys Ile Lys Asn Lys Val Lys Ala Ile Leu Gln Lys Leu(GKCNLLCKVKNKIKNKV KAILQKL)(SEQ ID NO.1)

实施例2，沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽的制备：

Ⅰ、沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽的制备方法：根据沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽的基因推断编码有功能的成熟丝氨酸蛋白酶抑制肽氨基酸序列后用自动多肽合成仪合成多肽。二硫键的形成采用空气氧化法，具体为在烧瓶中将多肽溶解按照0.1mg/ml于0.1％醋酸溶液中后用氢氧化铵滴定成pH 7.8,然后室温搅拌过夜。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。纯化时A液体为0.05％TFA+2％CH₃CN，B液为0.05％TFA+90％CH₃CN，B液浓度梯度为25min15-40％，检测波长为220nm，多肽出现在第20分钟。

Ⅱ、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry,FAB-MS)，以甘油:间硝基苄醇:二甲亚砜(1:1:l，V:V:V，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。

Ⅲ、纯化的沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽用高效液相色谱(HPLC)方法鉴定其纯度，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽是中国两栖类动物沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽基因编码的一种环状多肽，分子量2725.12道尔顿，等电点10.232，其氨基酸序列为：Gly Lys Cys Asn Leu Leu Cys Lys Val Lys Asn Lys Ile Lys Asn Lys Val Lys Ala Ile Leu Gln Lys Leu(GKCNLLCKVKNKIKNKVKAILQKL)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸形成分子内二硫键使分子成环。

实施例3，沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽的活性实验：

Ⅰ、抑制细菌生长能力测定

抗菌活性检测采用杯碟法，培养基为普通琼脂培养基。分别注入加热融化的培养基20m1于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入5m1菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的不锈钢杯6个。第一个钢杯加入0.1-0.3mg/ml浓度的待测多肽溶液0.l ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，观察抑菌圈大小。抑菌圈l0mm以上的作为最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)。细菌菌株来源于昆明医学院第一附属医院，此试验重复四次，取平均值，结果如表1所示，合成的沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽能显著的抑制细菌生长。

表1.沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽抑制细菌生长活性

Ⅱ、抑制真菌生长能力测定

抗真菌活性检测采用杯碟法，培养基为改良沙保氏(Sabousand)培养基。分别注入加热溶化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底均匀摊布，凝固后另取培养基适量加热溶化，分别向每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离放入已消毒的不锈钢杯5个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测多肽溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，24h-48h后测量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作为最小抑菌浓度(MIC)。细菌菌株来源于云南大学微生物研究所，此实验做三个平行，取几何平均值，结果如表2所示，合成的沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽能显著的抑制真菌生长。

表2.沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽抑制真菌生长活性

Ⅲ、丝氨酸蛋白酶抑制剂活性测定

不同量的沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽溶解于0.05M Tris-HCl缓冲液与一定量的胰蛋白酶(最终浓度为40μg/ml)于0.05M Tris-HCl缓冲液于室温下保温2min，最后加入发色底物S-2238(终浓度为40μg/ml)启动反应，应用PERKIN ELMER(美国)公司生产的分光光度计于处监测吸收值变化2min,加入同样体积的0.05M Tris-HCl缓冲液与空白对照,抑制常数Ki＝[I]/(V0/VI+1)计算。[I]为沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽的摩尔浓度，V0为空白对照是胰蛋白酶与发色底物的反应速度，V1为加入沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽后胰蛋白酶与发色底物的反应速度。此试验重复六次，取平均值。

结果如图3所示，沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽能很有效地抑制胰蛋白酶的活性，在上述试验条件下抑制半数胰蛋白酶活性所需要的沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽浓度为1.965μM,对胰蛋白酶的抑制常数Ki是8×10^-6M。丝氨酸蛋白酶抑制剂对生物体内的生理生化功能都有重要的影响。如，它们在血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成及转运、细胞内蛋白质水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等方面都有重要作用。沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽能很有效地抑制胰蛋白酶，证实其能在体内调节众多的生理过程和有广泛的临床应用价值。胃炎、胰腺炎的发病过程涉及许多丝氨酸蛋白水解作用，因此抑制这些酶的水解能防止疾病的发生和减低随后的炎症因子对机体造成的损害。具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽能应用与炎症相关的胃炎、胰腺炎中。

Ⅳ、抑制肿瘤生长活性测定

在96孔细胞培养板上，将待测样品用完全培养基进行5倍或2倍倍比稀释，共六个稀释度，每个稀释度设3个重复孔，每孔100μl，同时设置正常细胞对照。每孔滴加3×10⁵个/ml的NCI-h460、MCF-7和MDA-MB-231细胞100μl。置37℃，5％CO₂培养箱内培养。48小时后用MTT法测定待测化合物对细胞的毒性作用。EC₅₀是对50％宿主细胞产生细胞毒性作用时的浓度。

表1沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽抑制肿瘤细胞生长的作用

由表1可见，沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽能显著抑制肺癌细胞系(NCI-h460)和两种乳腺癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)的生长，这表明沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽具有很强的抑制肿瘤细胞生长作用，同时还具有序列简单、合成方便等优点。可作为制备治疗肿瘤、胃炎、胰腺炎药物的应用。

Ⅴ、促胰岛素释放活性测定

沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽的促进胰岛素释放活性采用葡萄糖诱导的胰岛素释放活性检测方法(GSIS，Glucose-stimulated insulin secretion)测定。具体步骤如下：大鼠胰岛细胞瘤INS-1细胞用含100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、10％胎牛血清和11.1mM葡萄糖的RPMI-1640 37℃5％CO₂在24孔细胞培养板中培养，细胞形成单层后用pH 7.4，含5.6或16.8mM葡萄糖、0.1％牛血清白蛋白的Krebs–Ringer bicarbonate缓冲液中37℃预孵育40min，吸去上清，细胞同含样品的同样缓冲液37℃预孵育20min，吸去上清，1000rpm离心10min，上清液用于胰岛素含量检测，每个样品4个重复。胰岛素含量用上海酶研公司生产的胰岛素ELISA检测试剂盒按照说明书检测。结果见说明书附图4。由说明书附图4可见，沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽具有显著的促进胰岛素释放的作用，INS-1细胞释放出的胰岛素随着沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽浓度的增加呈现上升的趋势。因此，沼水蛙丝氨酸蛋白酶抑制肽具有降低血糖的生物活性，可作为制备治疗糖尿病药物的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 沼水蛙皮肤丝氨酸蛋白酶抑制肽及其基因和制药应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> Hylarana guentherip

<400> 1

Gly Lys Cys Asn Leu Leu Cys Lys Val Lys Asn Lys Ile Lys Asn Lys

1 5 10 15

Val Lys Ala Ile Leu Gln Lys Leu

20

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaagacct ggcagtgtgt gctatgg 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attctagagg ccgaggcggc cgacatg 27

<210> 4

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaagacct ggcagtgtgt gctatggctc tgcgccgtca cattggaggt cgctcactct 60

cagtctctgg atcaggaaga attgatcaaa gaagctctgg atctctacaa ccagagggaa 120

gatggagagt tcctctttaa gttcctgtct gagctcccca accccctccc aaagggggag 180

ggagactctc cagcaatcac ttttttgatc aaggagacgg actgtcccaa atctgaagac 240

aatgacttgg agccatgtga ctacaaggag gacggggagg tgaaggtctg cgctctggag 300

gacgaggatg tgaaatgcgc cagtctgtcc gagaattacc gaaccaagag atccaatgga 360

aacggaaagt gcaacttact ctgcaaagtg aaaaataaga taaaaaataa ggtcaaggct 420

atcctgcaaa aattataa 438

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<211> 24

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<400> 5

gagcggataa caatttcaca cagg 24

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<213> 人工序列

<400> 6

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24