一种伯氏疏螺旋体的PCR检测用引物和检测方法与流程

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种用于检测伯氏疏螺旋体病原核酸的PCR方法。

背景技术：

伯氏疏螺旋体属于原核生物界（Kingdom Monera）、螺旋体目（Spirochaetidae ）、螺旋体科（Spirochaetaceae）、疏螺旋体属（Borrelia）（也称包柔式螺旋体属）。革兰氏染色阴性，但不易着色，吉姆萨染、荧光染料染色着色良好，显微镜下可看到细长的螺旋体。伯氏疏螺旋体具有多个鞭毛，有大而疏的螺旋3-10个，长10-30μm，宽0.2-0.25μm，由表层、外膜、鞭毛、原生质四部分组成。在液体培养基中数个螺旋体可不规则地缠绕在一起，呈扭曲状态运动。经蜱传播，可感染禽类等动物，可引起禽螺旋体病( Avian Spirochaetosis, AS)。对人们的食品安全存在威胁，目前为止尚未见针对该病原的快速检测方法，亟需一种快速检测伯氏疏螺旋体的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是建立一种快速检测伯氏疏螺旋体病原的方法，可用于食品安全或肉制品的进出口快速检测。

实现本发明的采用的具体技术方案如下：

一种伯氏疏螺旋体的PCR检测用引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO.1的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的下游引物。

本发明还提供了一种利用上述引物的检测伯氏疏螺旋体非疾病诊断目的的PCR检测方法，包括以下步骤：

1）用细菌核酸提取试剂盒提取待检样品的核酸，获得核酸模板；

2）PCR扩增反应

扩增体系：每25μL扩增体系中包含2×PCR Premix缓冲液12.5μL， 25μmol/L 上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2各0.5μL，步骤1）所获核酸模板溶液1μL，超纯水补体积至25μL；

扩增参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸lmin，扩增35个循环，最后一个循环于72℃延伸5min；

3）将步骤2）中的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；

4）结果分析：若有扩增产物目的条带出现则待测样品中有伯氏疏螺旋体，否则没有。

与现有的传统螺旋体检测方法相比，本发明主要优点在于：

1、特异性高：一对引物对伯氏疏螺旋体的基因组特异性区域识别，保证PCR扩增的高度特异性，传统方法则需要分离鉴定、通过形态特征和生化试验，进行检测。

2、检测周期短：从采集样本完成起，4个小时即可完成PCR检测和结果的报告，而传统方法完成分离鉴定至少7天以上，且伯氏疏螺旋体需要严格的厌氧培养条件，实现体外分离培养比较困难。

3、稳定性高：同一样品经不同的人完成检测，结果的一致性强，尤其适用于大规模、高通量样品的检测分析，一次可以处理几十个样本。

附图说明

图1为伯氏疏螺旋体PCR检测结果示意图；

图中：M-DL2000核酸分子量标准；1.1-阳性对照；1.2-阳性样品；1.3-阴性对照；

图2为PCR特异性试验结果示意图；

图中：M-DNA marker； 2.1-阳性对照；2.2及2.3-阴性对照； 2.4-伯氏螺旋体，2.5-衣原体；2.6-支原体；2.7-泰勒虫。

具体实施方式

结合实例对本发明做进一步说明，不当作对本发明的限制。

根据伯氏疏螺旋体的基因组中编码鞭毛蛋白的fla基因为扩增的特异性靶基因，用Primer Premier 6.0设计了上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2，设计的引物由生工生物工程(上海)公司合成。序列如下：

SEQ ID NO.1：5′- CTTCTCAAGGCGGAGTTAA -3′；

SEQ ID NO.2：5′- CCTCATCTGTCATTGTAGCA -3′。

实施例1 病禽中伯氏疏螺旋体的PCR检测

采集禽类的全血经1000r/min离心10min后，取血清及血细胞交界处淡白色悬液200～500μL置入1.5 mL离心管中。对离心管中收集物经12000r/min离心10min后弃上清，收集沉淀用于提取核酸；同时设立伯氏疏螺旋体标准菌株培养物作为阳性对照；SPF鸡血为阴性对照。

核酸提取：向收集的沉淀中，加入500 μL抽提缓冲液（100 mmol/L氯化钠，10 mmol/L Tris-Cl pH 8.0，25 mmol/L EDTA pH 8.0，终浓度10 g/L SDS和终浓度0.1 g/L 蛋白酶K）悬浮后，55 ℃水浴中反应2 h，同时设立伯氏疏螺旋体标准菌株培养物作为阳性对照；SPF鸡血为阴性对照。

以上还可以选择采集禽类小肠、脾、肝、肾、心、肺等组织脏器，提取核酸。

加入等体积的苯酚：三氯甲烷：异戊醇（苯酚：三氯甲烷：异戊醇比例为25:24:1）反复12000 r/min离心10 min，将上层液体转移至另一个1.5 mL离心管中，加入1/10体积3 mol/L的乙酸钠和2倍体积无水乙醇，-20 ℃放置2 h（或更长时间）。12000 r/min离心10 min，弃去上清液。加入500 μL 70%冷乙醇洗涤一次，尽量弃去上清。待离心管中液体自然干燥后，加入50 μL双蒸水溶解沉淀，即为DNA模板，-70℃保存备用。核酸提取可使用等效的商品化细菌核酸提取试剂盒。

PCR扩增体系的配置和扩增参数：

扩增体系：每25μL扩增体系中包含2×PCR Premix缓冲液12.5μL， 25μmol/L SEQ ID NO.1的上游引物和SEQ ID NO.2的下游引物各0.5μL，核酸提取步骤中所获核酸溶液1μL，超纯水补体积至25μL；

扩增参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸lmin，扩增35个循环，最后一个循环于72℃延伸5min；

电泳检测步骤是：

配制50x TAE电泳缓冲液：其pH 8.5，所含成分40mMTris碱，40mM醋酸，1mMEDTA。

制胶：将50x TAE 电泳缓冲液稀释50 倍，配制成1 x TAE 电泳缓冲液，称取1.5克琼脂糖微波炉加热使其溶于100mL 的1 X TAE 电泳缓冲液中，加入1 滴lmg ／mL溴化乙锭，按样品数选择合适的梳子制备凝胶。

电泳：取5μL PCR产物点样到1.5％琼脂糖点样孔中，同时使用DL2000的DNA分子量标准，按5v/cm的电压计算所用电压，电泳时间25分钟，经凝胶成像系统观察。

阳性对照：即以伯氏疏螺旋体参考菌株核酸为模板进行的扩增，出现特异性扩增条带。

阴性对照无扩增条带，参照DNA 分子量标准，待检样品出现225bp的特异条带，伯氏疏螺旋体检测结果为阳性，如图1所示。

实施例2 伯氏疏螺旋体的PCR检测方法的特异性试验

取衣原体、支原体和泰勒虫三种感染禽后症状相似的三种病原做为特异性实验供试菌株。

核酸的提取，取以三种供试病原的纯培养分别提取核酸作为PCR扩增的模板。获得核酸溶液备用。

PCR扩增体系的配置和扩增参数：

扩增体系：每25μL扩增体系中包含2×PCR Premix缓冲液12.5μL， 25μmol/L SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2各0.5μL，核酸提取步骤中所获核酸溶液1μL，超纯水补体积至25μL；

扩增参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸lmin，扩增35个循环，最后一个循环于72℃延伸5min；

电泳检测步骤是：

配制50x TAE电泳缓冲液：其pH 8.5，所含成分40mMTris碱，40mM醋酸，1mMEDTA。

制胶：将50x TAE 电泳缓冲液稀释50 倍，配制成1 x TAE 电泳缓冲液，称取1.5克琼脂糖微波炉加热使其溶于100mL 的1 X TAE 电泳缓冲液中，加入1 滴lmg ／mL溴化乙锭，按样品数选择合适的梳子制备凝胶。

电泳：取5μL PCR产物点样到1.5％琼脂糖点样孔中，同时使用DL2000的DNA分子量标准，按5v/cm的电压计算所用电压，电泳时间25分钟，经凝胶成像系统观察。

阳性对照：即以伯氏疏螺旋体参考菌株核酸为模板进行的扩增，出现特异性扩增条带，见图2中2.4条带。

阴性对照无扩增条带，参照DNA 分子量标准，衣原体、支原体和泰勒虫三种感染禽后症状相似的三种病原无扩增，见图2中2.5,2.6和2.7条带，说明该方法对检测伯氏疏螺旋体是特异的。

废弃物处理：

依照当地或国家的传染性与潜在传染性废弃物处理规范来处理使用或未经使用过的试剂以及污染的废弃物。

<110> 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 一种伯氏疏螺旋体的PCR检测用引物和检测方法

<160> 2

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.1

cttctcaagg cggagttaa 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.2

cctcatctgt cattgtagca 20