一种高效表达MicrocinJ25的工程菌株及其发酵工艺的制作方法

本发明涉及一种工程菌株以及针对该工程菌株的发酵工艺，具体涉及一种高效表达MicrocinJ25的工程菌株以及针对该工程菌株的MicrocinJ25发酵工艺，属于基因工程
技术领域：
和发酵优化
技术领域：
。
背景技术：
：大肠杆菌容易产生耐药性，由其引起的疾病给畜牧养殖造成了巨大损失，目前迫切需要解决这个问题。MicrocinJ25(MccJ25)是大肠杆菌素的缩写，其表达菌是大肠杆菌。成熟的MccJ25是由21个氨基酸组成的套索肽，其中N端的第1个氨基酸至第8个氨基酸形成一个圆形环状结构，第9个氨基酸至第21个氨基酸形成发夹结构，发夹结构贯穿圆形环状结构，并通过非共价作用将这个尾部固定，理论上这个结构的理化性质非常稳定，能抵御强烈的变性条件，对温度、蛋白酶、酸碱等有良好的耐受性。通过实验验证，MccJ25能耐受121℃高温高压，模拟胃肠液处理后仍具有活性，可见MccJ25适合工业放大生产，并能到达动物肠道后端发挥作用。此外，通过体外抑菌实验发现，MccJ25能杀灭多种致病性大肠杆菌。综上，MccJ25可作为饲料添加剂使用，并具有开发为新兽药的潜力。MccJ25的表达菌是大肠杆菌，但是MccJ25野生基因簇的表达在实际应用中受限，主要体现在以下几方面：一、MccJ25野生基因簇的表达对有机氮源有较强的选择性，而有机氮是发酵成本的主要占用者。二、MccJ25的表达受铁离子影响较大，虽然可以通过加入螯合剂减轻铁离子的影响，但工业生产的各个环节均可产生铁离子，最终将导致加入的螯合剂超标，抑制菌体生长，因此工业生产中除铁不适用。三、现代追求高密度发酵，曲线的方式提高目标产物表达量，MccJ25野生基因簇的表达不依赖于细胞密度，但强烈依赖菌体生长状态，在平台期后期大量表达，不适合高密度发酵。四、工业生产追求稳定、高效和低成本，MccJ25野生基因簇的上述特点极易导致生产水平波动，造成生产成本提高。综上，有必要发展一套不依赖于氮源和生长状态的表达系统来表达MccJ25。目前，大肠杆菌商业化表达系统主要涉及单基因、单载体诱导表达，不适合多基因、多载体协同表达。合成生物学是近年发展起来的针对多基因协同表达技术，它结合生物信息手段，利用标准的生物学原件，例如启动子、核糖体结合位点(RBS)、终止子等，控制多基因的协同表达。中心法则已阐明，基因转录成mRNA，再翻译成蛋白质。这个过程受到各种调控，例如DNA甲基化、乙酰化、小RNA、启动子强度、RBS翻译效率、酶的浓度和活性、分裂周期等。对于大肠杆菌而言，启动子、RBS、酶浓度和细菌生长状态是影响目标蛋白表达量的主要因素。本发明拟结合传统生物技术和合成生物学的理论及提供的信息，利用大肠杆菌作为宿主菌，高效表达MccJ25。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供一种高效表达MccJ25的工程菌株。本发明的第二个目的在于提供一种针对上述工程菌株的MccJ25发酵工艺。为了实现上述两个目标，本发明采用如下的技术方案：一种高效表达MicrocinJ25的工程菌株，其特征在于，通过下述方法构建而成：分别将MicrocinJ25野生型基因簇的McjA、McjB+McjC+McjD基因构建到2个质粒中，转化大肠杆菌MC41OO，从而产生出一株高效表达MicrocinJ25的工程菌，该工程菌已于2016年08月23日保藏在了中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.12902，分类名称为大肠埃希氏菌Escherichiacoli。一种利用前述的高效表达MicrocinJ25的工程菌株发酵生产MicrocinJ25的工艺，其特征在于，包括以下步骤：Step1：准备种子罐，罐内培养基的组成为10g/L蔗糖+45g/L酵母浸粉+3g/L磷酸氢二钾+2g/L磷酸二氢钾+0.5g/L硫酸镁，初始pH≥6.2；Step2：将菌种接种于种子罐内，进行扩大培养；Step3：准备发酵罐，罐内培养基的组成为10g/L蔗糖+50g/L酵母浸粉+3g/L磷酸氢二钾+0.5g/L硫酸镁，初始pH6.2-6.5；Step4：将种液接种于发酵罐内，进行发酵培养。前述的工艺，其特征在于，在Step2中，培养的条件为：35℃-37℃，120rpm，通气20m3/h。前述的工艺，其特征在于，在Step2中，培养的时间为：8-10h。前述的工艺，其特征在于，在Step2中，培养过程中适当调整培养基的pH值，使pH≤7.0。前述的工艺，其特征在于，在Step4中，培养的条件为：35℃-37℃，80rpm，通气200m3/h。前述的工艺，其特征在于，在Step4中，培养的时间为：17-19h。前述的工艺，其特征在于，在Step4中，培养过程中前12h控制培养基的pH≤7.0。本发明的有益之处在于：(1)本发明通过对MccJ25野生型基因簇进行改造，使McjABCD基因位于不同质粒并转化大肠杆菌MC4100所构建的工程菌株能够高效表达MccJ25，实验室50L罐表达量达到600mg/L以上水平，工业生产30T罐表达量达到500mg/L水平。(2)发酵工艺：通过调整培养基碳氮源比例和发酵过程溶氧、pH等参数，获得了最优发酵效果，经上述工艺工程菌株能够高效表达MicrocinJ25，1T罐表达量达到600mg/L，30T罐表达量达到500mg/L，改善生产环境和设备后30T罐表达量达到600mg/L，现已是正常的生产水平。附图说明图1是DAB显色结果图；图2是化学发光显色结果图；图3是不同宿主菌中质粒pACYCJ252的表达量图；具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。第一部分：构建高效表达MicrocinJ25的工程菌株该工程菌株通过下述方法构建而成：分别将MicrocinJ25野生型基因簇的McjA、McjB+McjC+McjD基因构建到2个质粒中，转化大肠杆菌MC41OO，从而产生出一株高效表达MicrocinJ25的工程菌。下面详细介绍该工程菌株的构建过程。一、全基因合成MicrocinJ25基因簇根据文献报道，参考NCBI基因库中的序列JX077110(MicrocinJ25基因簇序列包含于此序列)，全基因合成MicrocinJ25基因簇。经重新测序，所合成的MicrocinJ25基因簇的序列为SEQIDNO:1。结论：所合成的MicrocinJ25基因簇序列完全正确。将合成的MicrocinJ25基因构建到常规载体中，看其是否表达；另外，将合成的MicrocinJ25基因作为后续研究的基因材料。二、构建表达载体采用分子克隆常规方法，将McjA基因、McjB基因、McjC基因、McjD基因分别与GFP融合，通过WesternBlot测定各基因的表达强度。DAB显色结果见图1。DAB显色法只检测到了“A-GFP”融合蛋白表达，表明McjA基因的表达量远远高于McjB基因、McjC基因和McjD基因。化学发光显色结果见图2。根据GFP标准品的含量，估算出McjB基因、McjC基因和McjD基因的表达量分别为0.76mg/L、0.97mg/L、0.39mg/L。基于此，我们设计构建BCD基因组成型表达载体和最优RBS+A基因组成型表达载体两种载体。1、构建BCD基因组成型表达载体(1)引物引物编号引物序列840f5’-CTTCTGACTATAATAGTCAGGGTAATTGAGTGTAAAGGCATAA-3’840f15’-AGGGGATCCTCTTTTTGATGCAATCCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGT-3’534r5’-TGACTGTTTTATTGTATTCACTAG-3’(2)启动子启动子来源于iGEM(InternationalGeneticallyEngineeredMachine)。通过比较相对活性，我们最终确定的最优启动子为：aattctctttttgatgcaatccgctttgcttctgactataatagtcagggtaag(编号为BBa_M13110，相对活性达到0.91)。(3)构建BCD基因组成型表达载体用编号为840f、840f1、534r的引物将启动子BBa_M13110同McjB基因、McjC基因、McjD基因拼接，BamHI/SpeI双切后插入质粒pACYCJ252相应的酶切位点中，构建BCD基因组成型表达载体，记为载体pDZ138。质粒pACYCJ252的构建方法如下：MicrocinJ25插入到pACYC177载体的BamHI和SphI酶切位点中，即得到pACYCJ252载体。2、构建最优RBS+A基因组成型表达载体(1)设计RBS根据网站(https://www.denovodna.com/software/)预测不同翻译起始效率的RBS，由引物公司合成。以合成的RBS作为上游引物，下游引物为738r(5’-CTCGTCGACGCCATAGAAAGATATAGGT-3’)，反应体系(50μL)为：反应buffer10μL、2.5mMdNTPs4μL、上下游引物各1μL、phusionDNA聚合酶0.5μL、模板pACYCJ2521μL和无菌水32.5μL。反应结束后切胶回收，BglII/SalI双切后插入质粒pDZ130(含有野生McjA基因的质粒)相应位点中，转化大肠杆菌DH5α菌株，挑取阳性克隆，测序验证序列，质粒以pDZ13xx命名。将质粒pDZ13xx同质粒pACYCJ252共转大肠杆菌DH5α菌株，氨苄青霉素和卡那霉素双卡选择，挑取单克隆提质粒酶切鉴定，阳性克隆用于RBS筛选。阳性克隆划线氨苄青霉素、卡那霉素双抗平板，37℃过夜培养，第二天挑单克隆于10ml试管中，装3mlLB，37℃、220rpm震荡培养12h，1％接种于250ml三角瓶中，装50mlLB，37℃、220rpm震荡培养20-24h，取上清进行HPLC测定。预测的RBS序列及其翻译起始效率以及HPLC测定结果见下表：测定结果表明：质粒pDZ1307表达量略高于质粒pDZ130，但是菌体生长滞后，不利于发酵工作；质粒pDZ1314、质粒pDZ1335和质粒pDZ1340菌体生长不良，主要表现为转化难生长，转化成功克隆OD值偏低，推测原因是它们的RBS结合能力较强，使包内RBS水平不足，干扰了其他代谢基因的表达。综合考虑，我们最终选择质粒pDZ130的RBS开展后续工作，最优RBS的序列为：TTCCATCAAATAAGGAACGTAAAAAGATCTACGAGAAAAAATAGCCCGCATAAGGAGGTCCCCA(859f)。(2)启动子对来源于iGEM(InternationalGeneticallyEngineeredMachine)的40个启动子对数期活性与启动子J23101(gatccgctagcataatacctaggactgagctagctgtaaag)比较，得到相对启动子活性(RPU)强弱排序，详见下表。在表中：由上到下，由左到右，RPU依次降低，其中高于启动子J23101的启动子有3个(启动子J8990、启动子J2930、启动子J8586)，其余均低于它。我们最终确定启动子J8990为最优启动子，其序列为：Gatccgctagcattatacctaggactgagctagctgtcaag。(3)引物935f：5’-AGCGGATCCACAGAAGGACGTGAGGT-3’835r：5’-ATAGAGCTCTTAACCGTAGAAACTGA-3’(4)构建最优RBS+A基因组成型表达载体以质粒pDZ130为模板扩增最优RBS+A基因，BamHI/SacI双切后插入质粒pDZ174中，启动子BBa_J8990插入质粒pDZ174的EcoRI/BamHI位点，构建最优RBS+A基因组成型表达载体，记为载体pDZ177。3、验证表达载体PCR反应体系：PCR反应程序：98℃×1min，98℃×15s、55℃×20s、72℃×30s，重复30个循环，72℃×2min。电泳检测，切胶回收连接载体。酶切反应体系：连接反应体系：连接反应条件：22℃反应1h，转化大肠杆菌DH5α菌株。挑取单克隆，提质粒测序验证，验证结果显示：BCD基因组成型表达载体和最优RBS+A基因组成型表达载体均构建成功。三、双质粒电转化感受态细胞1、筛选最佳宿主菌我们将单质粒pACYCJ252分别转化到大肠杆菌DH5α菌株、MG1655菌株、MC4100菌株、MC1061菌株、BL21菌株、JM109菌株、TOP10菌株和AB1133菌株中，相同条件下培养相同时间后，分别检测不同宿主菌中质粒pACYCJ252的表达量，检测结果见图3。所以，我们最终确定大肠杆菌MC4100菌株为最佳的宿主菌。2、双质粒电转化大肠杆菌MC4100菌株将构建成功的BCD基因组成型表达载体(即载体pDZ138)和最优RBS+A基因组成型表达载体(即载体pDZ177)共转到感受态细胞-大肠杆菌MC4100菌株中，具体的步骤为：(1)50ml宿主菌培养液(OD600≈0.2-0.3)倒入50ml离心管，冰浴10min；4℃，6000g离心8min；弃上清，加入50ml预冷无菌水，用5ml枪头吹打均匀，4℃，6000g离心10min；弃上清，加入40ml预冷10％甘油，用5ml枪头吹打均匀，4℃，6000g离心10min；加入30ml预冷10％甘油，用5ml枪头吹打均匀，4℃，6000g离心10min；弃上清，加入500μl预冷10％甘油，吹打均匀，90μl每管进行分装；(2)根据质粒浓度，将两种质粒(载体pDZ138和载体pDZ177)加入到感受态细胞中，1200v电压进行电击转化；(3)加入900ulLB培养基，37℃复苏培养1h，4000rpm离心3min，涂抗性平板；(4)次日挑取单克隆到LB中培养，提质粒，酶切鉴定。鉴定结论：双质粒成功电转化到了大肠杆菌MC4100菌株中。3、用氨苄青霉素和卡那青霉素双抗筛选BCD基因组成型表达载体(载体pDZ138)：氨苄青霉素抗性最优RBS+A基因组成型表达载体(载体pDZ177)：卡那霉素抗性用氨苄青霉素和卡那霉素双抗筛选菌株。4、HPLC检测MccJ25表达量将鉴定正确菌株过夜活化，次日转接到50ml培养基中，每种菌3个平行。37℃培养20-24h，各取1ml，12000rpm离心3min，取上清。用0.22um滤膜过滤上清，置于高效液相色谱仪进样瓶，检测。检测结果见见下表：载体pDZ171+载体pDZ138载体pDZ177+载体pDZ1381#2802652#2463843#218403平均2483516、小结将外源基因插入载体中进行表达是现有技术，外源基因要有启动子启动转录，终止子终止转录，核糖体结合位点启示翻译。在本发明中，我们将MicrocinJ25基因簇自身诱导型启动子替换为不受外界条件限制的组成型启动子，而且启动活性是在所筛选启动子中活性最高。同时，本发明也对McjA的RBS区进行了优化，提高了翻译效率，进而提高J25表达量。复制子不同质粒共转同一宿主菌是现有技术，本发明中将McjA构建到高拷贝质粒中，其复制子为ColE1，McjB+McjC+McjD构建到低拷贝质粒中，其复制子为p15A。共转方法有化学转化和电击转化，为提高转化效率，本发明采用电击方法进行转化。本发明中所用到载体骨架均来自常规基因工程载体，根据实验中对拷贝数要求和载体抗性而进行改造。本发明所用宿主可以为常用克隆和表达大肠杆菌宿主，通过共转后检测MicrocinJ25表达量，选择最优作为本发明宿主，即MC4100。2016年08月23日，我们将构建成功的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.12902，分类名称为大肠埃希氏菌Escherichiacoli。第二部分：工程菌株发酵条件的优化一、实验方法实验1：挑取菌株(保藏编号CGMCCNo.12902)单菌落于100ml三角瓶(装有20mlLB)，37℃、220rpm培养12-16小时，1％接种于250ml三角瓶中(装培养基50ml)于37℃、220rpm培养24小时，取适量培养液离心(12000rpm，5min)，取上清HPLC测定MccJ25表达量。实验2：挑取菌株(保藏编号CGMCCNo.12902)单菌落于100ml三角瓶(装有20mlLB)，37℃、220rpm培养12-16小时，1％接种于250ml三角瓶中(装培养基50ml)于37℃、220rpm培养8-10小时，火焰接种法接入发酵罐中，在发酵过程中每隔一定时间取样，离心(12000rpm，5min)，取上清HPLC测定MccJ25表达量。实验3：挑取菌株(保藏编号CGMCCNo.12902)单菌落于100ml三角瓶(装有20mlLB)，37℃、220rpm培养12-16小时，1％接种于250ml三角瓶中(装培养基50ml)于37℃、220rpm培养8-10小时，火焰接种法接入1吨种子罐中，种子罐培养6-8h，移种入30吨发酵罐，在发酵过程中每隔一定时间取样，离心(12000rpm，5min)，取上清HPLC测定MccJ25表达量。二、碳源筛选试验结果表明：(1)葡萄糖、果糖作碳源会使培养基迅速酸化，没有表达量；(2)甘油作为培养大肠杆菌(特别是工程菌)常用碳源在本实验中不适用，没有表达量；(3)蔗糖在比较中表现出优势。三、氮源筛选试验结果表明：有机氮源较无机氮源更有利于菌体生产，无机氮源培养菌体生长很差，酵母浸粉是最适合氮源。四、适合菌体生长碳氮比试验结果表明：随着碳氮比的下降，生物量逐渐上升后下降，但是MccJ25的表达量逐渐上升，这表明生物量与MccJ25表达量之间存在非线性关系，MccJ25表达需要一定的生物量但是生物量与表达量之间存在相互影响关系，应以MccJ25表达量作为主要评价指标。五、利于MccJ25表达碳氮比试验结果表明：适合的碳氮组合为10g/L蔗糖，40g/L酵母浸粉，摇瓶表达量可达235mg/L，以此为发酵培养基培养表达MccJ25培养基。六、发酵罐培养条件优化试验结果显示：10L罐培养的适合培养条件为37℃，0.4m3/h通气和250rpm。以此培养基和培养条件对通过基因改造后对铁离子和酵母浸粉不敏感的双质粒工程菌(保藏编号CGMCCNo.12902)作进一步的优化试验。七、发酵罐培养过程控制pH培养和实验室放大试验室在10L罐和50L罐培养表达MccJ25表达量都在600mg/l以上，最高可达700mg/l以上，达到预定目标，以此参数为依据，可以进行中试生产。八、中试生产条件及结果经验证，本发明所构建的工程菌株能够高效表达MicrocinJ25，1T罐表达量达到600mg/L，30T罐表达量达到500mg/L，改善生产环境和设备后30T罐表达量达到600mg/L以上将是正常的生产水平。九、总结最优发酵条件种子培养基的组成为：10g/L蔗糖+45g/L酵母浸粉+3g/L磷酸氢二钾+2g/L磷酸二氢钾+0.5g/L硫酸镁，初始pH≥6.2。种子培养的条件为：在35℃-37℃、120rpm、通气20m3/h条件下培养8-10h，培养过程中适当调整培养基的pH值，使pH≤7.0。发酵培养基的组成为：10g/l蔗糖+50g/l酵母浸粉+3g/l磷酸氢二钾+0.5g/l硫酸镁，初始pH6.2-6.5。发酵培养的条件为：在35℃-37℃、80rpm、通气200m3/h条件下培养17-19h，培养过程中前12h控制培养基的pH≤7.0。综上所述，本发明所构建的工程菌株能够高效表达MicrocinJ25，在实验室中30T罐表达量达到600mg/L以上，在工业生产中30T罐表达量达到500mg/L以上，改善生产环境和设备后30T罐表达量可以达到600mg/L，具有非常积极的推广应用价值。需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。SEQUENCELISTING<110>****（申请人名称）<120>一种高效表达MicrocinJ25的工程菌株及其发酵工艺<160>1<210>1<211>4440<212>DNA<213><220><221><222><400>1TCAGAATATCAGCCATAGAAAGATATAGGTGTACCAATCCCCACAAAATACTCAGGCACATGTCCTGCACCACCTTTTGTGAGTTGCGATGCTGATTTTT100TTATTTGTATAACCCCCTTTGCAGGAGATGGAACATTATTTTTTTTACCAGAAGACAGTTTATTAAAATGAAAATGCTTAATCATTTTTACGTTCCTTAT200TTGATGAAAATAGTATGATGATTTTTACAGAGGAACCTCACGTCCTTCTGTTAGAATTTTATTAGCACAAAATAAAATTGAGATCAATAATCATTACGCT300TTAGTAATTTATCAATAAAATTATTTAGATACAAACATCCATAAACTAATCAATCTGCAAAAGTGGTCAAATTTAGTACAATATTTTGGATTTTTATACA400TTTTTCTAATTATTTCAGAATATTTAGCCATCAATTAAGAAAAAAATTTAGCTTGTAGATAAATTCAGAAGTTTTATTATTCCAATTGAGTGTAAAGGCA500TAACTACAGGAGGGAGTGTGCAAAATGATCCGTTACTGCTTAACCAGTTATAGAGAGGATCTTGTTATCCTGGATATAATTAATGATAGTTTCAGCATAG600TGCCTGACGCAGGTAGCTTGCTAAAAGAAAGAGATAAATTGCTTAAAGAATTCCCACAACTATCTTACTTTTTTGACAGTGAATATCATATTGGAAGTGT700TTCTCGTAATAGTGACACTTCTTTTCTTGAAGAACGCTGGTTTCTACCAGAACCTGACAAAACATTATATAAGTGTTCTCTATTTAAACGATTTATATTA800TTACTCAAAGTCTTTTACTATAGCTGGAATATTGAAAAAAAAGGGATGGCATGGATTTTCATAAGTAATAAAAAAGAGAATAGGCTATACTCCTTGAATG900AAGAGCATCTTATCCGGAAAGAAATTAGTAATCTTTCCATTATCTTTCATCTTAATATTTTTAAATCTGACTGTCTTACCTATTCATACGCACTAAAAAG1000AATTCTTAATTCCAGAAATATTGATGCTCATCTTGTTATTGGTGTAAGGACACAACCTTTTTATAGCCACTCTTGGGTGGAGGTTGGGGGACAAGTTATC1100AATGATGCTCCCAATATGCGGGATAAATTATCTGTTATTGCAGAGATATAGTTATGGAAATATTTAATGTCAAGTTAAATGATACTTCAATTAGAATTAT1200TTTCTGTAAAACGCTTTCTGCCTTCCGGACAGAAAATACCATCGTTATGCTCAAAGGAAAAGCAGTTTCAAATGGCAAACCTGTATCCACAGAGGAGATT1300GCCAGAGTAGTGGAAGAAAAAGGTGTTTCAGAAGTAATAGAAAATTTAGATGGTGTTTTCTGTATCCTAATTTATCATTTTAATGATCTCCTTATAGGGA1400AAAGCATTCAATCAGGCCCCGCTCTATTTTATTGTAAAAAGAATATGGATATTTTTGTTTCGGATAAAATTTCTGATATCAAATTTTTGAATCCAGATAT1500GACATTCAGTCTAAATATAAAAATGGCAGAACATTATCTGTCAGGAAATCGAATAGCAACCCAGGAATCACTAATCACTGGCATTTACAAAGTAAATAAT1600GGTGAGTTTATAAAATTTAATAATCAGTTGAAACCTGTGCTACTTCG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