一种生产葡萄糖氧化酶的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产葡萄糖氧化酶的方法。

背景技术：

葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，god)是一种主要由霉菌产生的氧化酶类，可以将葡萄糖氧化生成葡萄糖醛酸，同时利用分子氧作为电子受体，产生过氧化氢，因此广泛应用于食品、医药、饲料和工业生产等行业。

目前国内生产葡萄糖氧化酶水平较低，酶制剂纯度普遍较低，每年仍需大量依赖进口，市场价格居高不下。

毕赤酵母(pichiapastoris)表达系统是在1980年之后开始快速发展的一种甲醇营养型酵母表达系统，目前已有近500种外源蛋白在该系统中成功表达。它不仅克服了原核表达系统背景蛋白多、不能分泌表达外源蛋白和不能表达结构复杂的蛋白等缺陷，还弥补了高等真核表达系统操作复杂、表达水平低和产业化生产成本高的不足，同时具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处，如成功避免了酿酒酵母

(saccharomycescerevisiae)蛋白分泌表达效率低、表达质粒易丢失等缺陷。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种生产葡萄糖氧化酶的方法。

本发明首先提供了一种重组菌(重组菌甲)，是将葡萄糖氧化酶(god蛋白)的编码基因和分子伴侣的编码基因导入出发菌得到的。

本发明还提供了一种重组菌(重组菌乙)，是赋予出发菌葡萄糖氧化酶活性和分子伴侣活性得到的。

所述分子伴侣具体可为二硫键异构酶(pdi蛋白)和结核免疫球蛋白(bip蛋白)。

所述分子伴侣具体可为二硫键异构酶(pdi蛋白)。

所述分子伴侣具体可为结核免疫球蛋白(bip蛋白)。

所述葡萄糖氧化酶为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；

(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。

所述葡萄糖氧化酶的编码基因为如下(a3)、(a4)、(a5)或(a6)：

(a3)编码区如序列表的序列2第1至1749位核苷酸所示的dna分子；

(a4)编码区如序列表的序列2所示的dna分子；

(a5)在严格条件下与(a3)或(a4)限定的dna序列杂交且编码葡萄糖氧化酶的dna分子；

(a6)与(a3)或(a4)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码葡萄糖氧化酶的dna分子。

所述二硫键异构酶为如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列3所示的蛋白质；

(b2)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。

所述二硫键异构酶的编码基因为如下(b3)、(b4)、(b5)或(b6)：

(b3)编码区如序列表的序列4第1至1551位核苷酸所示的dna分子；

(b4)编码区如序列表的序列4所示的dna分子；

(b5)在严格条件下与(b3)或(b4)限定的dna序列杂交且编码二硫键异构酶的dna分子；

(b6)与(b3)或(b4)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码二硫键异构酶的dna分子。

所述结核免疫球蛋白为如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表的序列5所示的蛋白质；

(c2)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。

所述结核免疫球蛋白的编码基因为如下(c3)、(c4)、(c5)或(c6)：

(c3)编码区如序列表的序列6第1至2034位核苷酸所示的dna分子；

(c4)编码区如序列表的序列6所示的dna分子；

(c5)在严格条件下与(c3)或(c4)限定的dna序列杂交且编码结核免疫球蛋白的dna分子；

(c6)与(c3)或(c4)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码结核免疫球蛋白的dna分子。

上述严格条件可为用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

所述重组菌具体可为将葡萄糖氧化酶的编码基因、二硫键异构酶的编码基因和结核免疫球蛋白的编码基因导入出发菌得到的。葡萄糖氧化酶的编码基因、二硫键异构酶的编码基因和结核免疫球蛋白的编码基因可以借助同一个表达载体导入出发菌，也可以借助同两个表达载体(即其中两个基因共用一个表达载体，第三个基因借助另一个表达载体；具体可说，二硫键异构酶的编码基因和结核免疫球蛋白的编码基因可以共用一个表达载体，葡萄糖氧化酶的编码基因借助另一个表达载体)导入出发菌，也可以借助三个质粒(即每个基因各借助一个表达载体)导入出发菌。所述重组菌的构建方法具体如下：将重组质粒甲和重组质粒乙导入出发菌，得到重组菌；所述重组质粒甲为将葡萄糖氧化酶的编码基因插入表达载体甲的多克隆位点得到的重组表达载体；所述重组质粒乙为将二硫键异构酶的编码基因和结核免疫球蛋白的编码基因插入表达载体乙的多克隆位点得到的重组表达载体。所述表达载体甲具体可为ppic9k载体。所述重组质粒甲具体可为重组质粒ppic9k-god。重组质粒ppic9k-god的构建方法：在ppic9k载体的ecorⅰ和notⅰ酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链dna分子。所述表达载体乙具体可为ppiczαa载体。所述重组质粒乙具体可为重组质粒ppicz-bip-pdi。重组质粒ppicz-bip-pdi为序列表的序列7所示的环形质粒。

所述重组菌具体可为将葡萄糖氧化酶的编码基因和二硫键异构酶的编码基因导入出发菌得到的。葡萄糖氧化酶的编码基因和二硫键异构酶的编码基因可以借助同一个表达载体导入出发菌，也可以借助同两个表达载体(即每个基因各借助一个表达载体)导入出发菌。所述重组菌的构建方法具体如下：将重组质粒甲和重组质粒乙导入出发菌，得到重组菌；所述重组质粒甲为将葡萄糖氧化酶的编码基因插入表达载体甲的多克隆位点得到的重组表达载体；所述重组质粒乙为将二硫键异构酶的编码基因插入表达载体乙的多克隆位点得到的重组表达载体。所述表达载体甲具体可为ppic9k载体。所述重组质粒甲具体可为重组质粒ppic9k-god。重组质粒ppic9k-god的构建方法：在ppic9k载体的ecorⅰ和notⅰ酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链dna分子。所述表达载体乙具体可为ppiczαa载体。所述重组质粒乙具体可为重组质粒ppicz-pdi。重组质粒ppicz-pdi的构建方法：在ppiczαa载体的bstbⅰ和notⅰ酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的双链dna分子。

所述重组菌具体可为将葡萄糖氧化酶的编码基因和结核免疫球蛋白的编码基因导入出发菌得到的。葡萄糖氧化酶的编码基因和结核免疫球蛋白的编码基因可以借助同一个表达载体导入出发菌，也可以借助同两个表达载体(即每个基因各借助一个表达载体)导入出发菌。所述重组菌的构建方法具体如下：将重组质粒甲和重组质粒乙导入出发菌，得到重组菌；所述重组质粒甲为将葡萄糖氧化酶的编码基因插入表达载体甲的多克隆位点得到的重组表达载体；所述重组质粒乙为将结核免疫球蛋白的编码基因插入表达载体乙的多克隆位点得到的重组表达载体。所述表达载体甲具体可为ppic9k载体。所述重组质粒甲具体可为重组质粒ppic9k-god。重组质粒ppic9k-god的构建方法：在ppic9k载体的ecorⅰ和notⅰ酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链dna分子。所述表达载体乙具体可为ppiczαa载体。所述重组质粒乙具体可为重组质粒ppicz-bip。重组质粒ppicz-bip的构建方法：在ppiczαa载体的bstbⅰ和notⅰ酶切位点之间插入了序列表的序列6所示的双链dna分子。

以上任一所述出发菌可为任何常用于表达外源蛋白的宿主菌。以上任一所述出发菌具体可为酵母，更具体可为毕赤酵母，例如毕赤酵母x33。

本发明还保护以上任一所述重组菌在制备葡萄糖氧化酶中的应用。

本发明还保护一种生产葡萄糖氧化酶的方法，包括如下步骤：培养所述重组菌，得到葡萄糖氧化酶。

所述生产葡萄糖氧化酶的方法具体包括如下步骤：采用bsm培养基培养所述重组菌。所述培养的条件具体可为30℃、500rpm振荡培养12-132小时。

所述生产葡萄糖氧化酶的方法具体包括如下步骤：

(1)将重组菌接种于bmgy培养基，培养至od600nm值为10；

(2)将10体积份步骤2得到的体系接种至90体积份bsm培养基，培养。

步骤(1)中，所述培养的条件具体可为30℃、220rpm振荡培养。

步骤(2)中，所述培养的条件具体可为30℃、500rpm振荡培养12-132小时。

所述生产葡萄糖氧化酶的方法具体包括如下步骤：将重组菌x33/ppic9k-god/ppicz-bip-pdi接种bsm培养基(初始od＝1-2)，30℃培养；培养过程由依次进行的阶段一和阶段二组成；

阶段一：培养过程中，通过加入28％浓氨水控制体系ph为5.0，通过调节搅拌转速和通气量控制体系溶氧为20％以上；当bsm培养基中的甘油耗尽从而引起溶氧上升时，开始以每升体系中每小时加入18.15ml的速率流加补料液甲(补料液甲为含有体积分数为1.2％ptm1和50g/100ml甘油的水溶液)，od600nm为150-200时停止补料，停止补料后继续培养30分钟-2小时；

阶段二：培养过程中，通过加入28％浓氨水控制体系ph为6.0，通过调节搅拌转速和通气量控制体系溶氧为10％以上；培养过程中，以每升体系中每小时加入5g的速率流加补料液乙(补料液乙为含有体积分数为1.2％ptm1的甲醇)，同时以每千克体系中每小时加入50g的速率流加山梨醇。

所述生产葡萄糖氧化酶的方法具体包括如下步骤：将重组菌x33/ppic9k-god/ppicz-bip-pdi接种bsm培养基(初始od＝1-2)，30℃培养150小时；培养过程由依次进行的阶段一和阶段二组成(连续计时)；

阶段一：培养过程中，通过加入28％浓氨水控制体系ph为5.0，通过调节搅拌转速和通气量控制体系溶氧为20％以上；第19小时开始以每升体系中每小时加入18.15ml的速率流加补料液甲(补料液甲为含有体积分数为1.2％ptm1和50g/100ml甘油的水溶液)，第23小时开始停止补料，停止补料后继续培养1小时；

阶段二：培养过程中，通过加入28％浓氨水控制体系ph为6.0，通过调节搅拌转速和通气量控制体系溶氧为10％以上；培养过程中，第24小时开始以每升体系中每小时加入5g的速率流加补料液乙(补料液乙为含有体积分数为1.2％ptm1的甲醇)，同时以每千克体系中每小时加入50g的速率流加山梨醇。

本发明还保护分子伴侣在促进微生物表达葡萄糖氧化酶中的应用。所述分子伴侣具体可为二硫键异构酶(pdi蛋白)和结核免疫球蛋白(bip蛋白)。所述分子伴侣具体可为二硫键异构酶(pdi蛋白)。所述分子伴侣具体可为结核免疫球蛋白(bip蛋白)所述微生物具体可为酵母，更具体可为毕赤酵母，例如毕赤酵母x33。所述出发微生物具体可为在毕赤酵母x33中导入葡萄糖氧化酶的编码基因得到的重组菌。

本发明还保护一种提高葡萄糖氧化酶在微生物中的表达水平的方法，包括如下步骤：在出发微生物中导入分子伴侣的编码基因，从而提高其表达葡萄糖氧化酶的水平。所述出发微生物为表达葡萄糖氧化酶的微生物。所述微生物具体可为酵母，更具体可为毕赤酵母，例如毕赤酵母x33。所述出发微生物具体可为在毕赤酵母x33中导入葡萄糖氧化酶的编码基因得到的重组菌。

本发明还保护一种提高葡萄糖氧化酶在微生物中的表达水平的方法，包括如下步骤：增加微生物中分子伴侣的水平，从而提高微生物表达葡萄糖氧化酶的水平。所述微生物为表达葡萄糖氧化酶的微生物。所述微生物具体可为酵母，更具体可为毕赤酵母，例如毕赤酵母x33。所述出发微生物具体可为在毕赤酵母x33中导入葡萄糖氧化酶的编码基因得到的重组菌。

本发明对增强葡萄糖氧化酶的分泌表达以及工业化生产有重要意义。

附图说明

图1为不同取样时间得到的上清液的电泳图。

图2为不同取样时间得到的上清液的葡萄糖氧化酶酶活。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

ppic9k载体：invitrogen，其产品目录号为v17520；ppic9k载体中位于多克隆位点(mcs)上游的启动子为aox1启动子，在aox1启动子下游且mcs上游有信号肽，信号肽带有起始密码子atg，因此在mcs处插入的外源基因可以没有起始密码子，只要三联密码子与之相符，没有移码即可，在蛋白表达加工成熟的过程中信号肽会自行切除。毕赤酵母(pichiapastoris)x33，简称毕赤酵母x33：invitrogen，货号为c18000。ppiczαa载体：invitrogen公司，货号为v19020。

葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase)简称god蛋白。结核免疫球蛋白(bindingimmunoglobulinprotein)简称bip蛋白。二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase)简称pdi蛋白。

bmgy培养基(1l)：酵母浸出物10g、蛋白胨20g、ynb13.4g、生物素400μg、甘油10g，余量为ph6.0、100mm的磷酸钾缓冲液。

bsm培养基(1l)：85％h3po4水溶液26.7ml、caso40.93g、k2so418.2g、mgso4·7h2o14.9g、koh4.13g、甘油40g、过滤除菌后的ptm14.35ml，余量为水。

ptm1(1l)：cuso4·5h2o6g、nai0.08g、mnso4·h2o3g、namoo4·2h2o0.2g、h3bo30.02g、cocl20.5g、zncl220g、feso4·7h2o65g、biotin0.2g、98％h2so4水溶液5ml，余量为水。

实施例1、构建重组菌

一、构建重组菌x33/ppic9k-god

1、构建重组质粒ppic9k-god。根据测序结果，对重组质粒ppic9k-god进行结构描述如下：在ppic9k载体的ecorⅰ和notⅰ酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链dna分子。序列表的序列2所示的dna分子为god基因，编码序列表的序列1所示的god蛋白。外源蛋白胞外表达。

2、将重组质粒ppic9k-god用限制性内切酶bglii线性化，然后导入毕赤酵母x33，得到重组菌，将其命名为x33/ppic9k-god。

二、构建重组菌x33/ppic9k-god/ppicz-pdi

1、构建重组质粒ppicz-pdi。根据测序结果，对重组质粒ppicz-pdi进行结构描述如下：在ppiczαa载体的bstbⅰ和notⅰ酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的双链dna分子。序列表的序列4所示的dna分子为pdi基因，编码序列表的序列3所示的pdi蛋白。由于插入位点为bstbⅰ和notⅰ之间，所以去除了ppiczαa载体中编码α-mating信号肽的核苷酸，外源蛋白胞内表达。

2、将重组质粒ppicz-pdi用限制性内切酶sacⅰ线性化，然后导入x33/ppic9k-god，得到重组菌，将其命名为x33/ppic9k-god/ppicz-pdi。

三、构建重组菌x33/ppic9k-god/ppicz-bip

1、构建重组质粒ppicz-bip。根据测序结果，对重组质粒ppicz-bip进行结构描述如下：在ppiczαa载体的bstbⅰ和notⅰ酶切位点之间插入了序列表的序列6所示的双链dna分子。序列表的序列6所示的dna分子为bip基因，编码序列表的序列5所示的bip蛋白。

2、将重组质粒ppicz-bip用限制性内切酶sacⅰ线性化，然后导入x33/ppic9k-god，得到重组菌，将其命名为x33/ppic9k-god/ppicz-bip。

四、构建重组菌x33/ppic9k-god/ppicz-bip-pdi

1、以重组质粒ppicz-bip为出发载体，构建重组质粒ppicz-bip-pdi。经测序验证，重组质粒ppicz-bip-pdi为序列表的序列7所示的环形质粒。序列表的序列7中，第938-2974位核苷酸为bip基因，第4342-5895位核苷酸为pdi基因。

2、将重组质粒ppicz-bip-pdi用限制性内切酶sacⅰ线性化，然后导入x33/ppic9k-god，得到重组菌，将其命名为x33/ppic9k-god/ppicz-bip-pdi。

五、构建重组菌x33/ppic9k和重组菌x33/ppic9k/ppicz

将ppic9k载体用限制性内切酶bglii线性化，然后导入毕赤酵母x33，得到重组菌，将其命名为x33/ppic9k。

将ppiczαa载体用限制性内切酶sacⅰ线性化，然后导入x33/ppic9k，得到重组菌，将其命名为x33/ppic9k/ppicz。

实施例2、检测重组菌生产葡萄糖氧化酶的能力

试验菌株为：重组菌x33/ppic9k-god、重组菌x33/ppic9k-god/ppicz-pdi、重组菌x33/ppic9k-god/ppicz-bip、重组菌x33/ppic9k-god/ppicz-bip-pdi、重组菌x33/ppic9k、重组菌x33/ppic9k/ppicz或毕赤酵母x33。

1、取试验菌株，30℃、220rpm振荡培养24h，得到种子液。

2、将1体积份步骤1得到的种子液接种于99体积份bmgy培养基，30℃、220rpm振荡培养至od600nm值为10。

3、将10体积份步骤2得到的体系接种至90体积份bsm培养基，30℃、500rpm振荡培养。培养过程中，每12小时取样，4℃、10000rpm离心10min，收集上清液。将上清液进行聚丙烯酰氨凝胶电泳。检测上清液的葡萄糖氧化酶酶活。检测上清液中的god蛋白浓度(god蛋白胞外表达，pdi蛋白和bip蛋白均胞内表达，所以god蛋白浓度以上清液中的总蛋白浓度计)。

葡萄糖氧化酶酶活测定方法如下：

①取上清液，用ph5.0、50mm的pbs缓冲液稀释，得到稀释液。

②制备反应体系(3.1ml)：由100μl步骤①得到的稀释液、100μlhrp溶液和2.9ml邻联茴香胺-葡萄糖溶液组成。hrp溶液中的hrp浓度为300u/ml。邻联茴香胺-葡萄糖溶液的溶剂为ph5.0、50mm醋酸缓冲液；溶质及其浓度如下：2mm邻联茴香胺、10g/100ml葡萄糖。ph4.5、50mm醋酸缓冲液：溶剂为水，溶质是醋酸和醋酸钠；醋酸钠的浓度为50mm，用醋酸调ph值为4.5。

③步骤②得到的反应体系，37℃静置反应1min。

利用uv1800在500nm波长处，测定反应前和反应后的吸光值，反应后的吸光值-反应前的吸光值＝△g。酶活力＝(△g×v总)/(ε×l)；v总＝3.1ml，ε＝7.5×10³m^-1·cm^-1；

l为比色杯的光径，本试验中l＝0.1cm。

1个酶活力单位是指在37℃、ph5.0条件下，在1min内转化1μmol葡萄糖生成1μmol葡萄糖酸和h2o2所需的酶量。

不同取样时间得到的上清液的电泳图见图1。图1中，a为x33/ppic9k-god；b为x33/ppic9k-god/ppicz-bip，c为x33/ppic9k-god/ppicz-pdi，d为x33/ppic9k-god/ppicz-bip-pdi。图1中就箭头标注god蛋白。

不同取样时间得到的上清液的葡萄糖氧化酶酶活见图2(五次重复试验的平均值)。培养132小时得到的上清液的葡萄糖氧化酶酶活见表1(五次重复试验的平均值)。

表1

结果表明，表达pdi蛋白、表达bip蛋白、同时表达pdi蛋白和bip蛋白，都可以增加重组菌生产god蛋白的能力，其中同时表达pdi蛋白和bip蛋白的效果尤为突出。

实施例3、应用重组菌通过发酵罐大规模生产葡萄糖氧化酶

将重组菌x33/ppic9k-god/ppicz-bip-pdi接种至装有bsm培养基的发酵罐(初始od600nm＝1-2)，30℃培养。阶段一完成后进行阶段二，阶段一和阶段二连续进行。

阶段一：培养过程中，通过加入28％浓氨水控制体系ph为5.0，通过调节搅拌转速和通气量控制体系溶氧为20％以上；当bsm培养基中的甘油耗尽从而引起溶氧上升时，开始以每升体系中每小时加入18.15ml的速率流加补料液甲(补料液甲为含有体积分数为1.2％ptm1和50g/100ml甘油的水溶液)，od600nm为150-200时停止补料，停止补料后继续培养30分钟-2小时。

阶段二：培养过程中，通过加入28％浓氨水控制体系ph为6.0，通过调节搅拌转速和通气量控制体系溶氧为10％以上；培养过程中，以每升体系中每小时加入5g的速率流加补料液乙(补料液乙为含有体积分数为1.2％ptm1的甲醇)，同时以每千克体系中每小时加入50g的速率流加山梨醇。

具体的一次过程如下：将重组菌x33/ppic9k-god/ppicz-bip-pdi接种至装有3lbsm培养基的5l规格发酵罐(初始od600nm＝1)；第19小时开始流加补料液甲，第23小时开始停止补料，第24小时开始流加补料液乙和山梨醇。培养150小时后，上清液的葡萄糖氧化酶酶活达到957u/ml(酶活检测方法同实施例2)。

序列表

<110>福建力多利生物科技有限公司

<120>一种生产葡萄糖氧化酶的方法

<130>gncyx161988

<160>7

<210>1

<211>583

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

serasnglyileglualaserleuleuthraspprolysaspvalser

151015

glyargthrvalasptyrileilealaglyglyglyleuthrglyleu

202530

thrthralaalaargleuthrgluasnproasnileservalleuval

354045

ilegluserglysertyrgluseraspargglyproileilegluasp

505560

leuasnalatyrglyaspilepheglyserservalasphisalatyr

65707580

gluthrvalgluleualathrasnasnglnthralaleuileargser

859095

glyasnglyleuglyglyserthrleuvalasnglyglythrtrpthr

100105110

argprohislysalaglnvalaspsertrpgluthrvalpheglyasn

115120125

gluglytrpasntrpaspasnvalalaalatyrserleuglnalaglu

130135140

argalaargalaproasnalalysglnilealaalaglyhistyrphe

145150155160

asnalasercyshisglyvalasnglythrvalhisalaglyproarg

165170175

aspthrglyaspasptyrserproilevallysalaleumetserala

180185190

valgluaspargglyvalprothrlyslysasppheglycysglyasp

195200205

prohisglyvalsermetpheproasnthrleuhisgluaspglnval

210215220

argseraspalaalaargglutrpleuleuproasntyrglnargpro

225230235240

asnleuglnvalleuthrglyglntyrvalglylysvalleuleuser

245250255

glnasnglythrthrproargalavalglyvalglupheglythrhis

260265270

lysglyasnthrhisasnvaltyralalyshisgluvalleuleuala

275280285

alaglyseralavalserprothrileleuglutyrserglyilegly

290295300

metlysserileleugluproleuglyileaspthrvalvalaspleu

305310315320

provalglyleuasnleuglnaspglnthrthralathrvalargser

325330335

argilethrseralaglyalaglyglnglyglnalaalatrppheala

340345350

thrpheasngluthrpheglyasptyrserglulysalahisgluleu

355360365

leuasnthrlysleugluglntrpalagluglualavalalaarggly

370375380

glyphehisasnthrthralaleuleuileglntyrgluasntyrarg

385390395400

asptrpilevalasnhisasnvalalatyrsergluleupheleuasp

405410415

thralaglyvalalaserpheaspvaltrpaspleuleuprophethr

420425430

argglytyrvalhisileleuasplysaspprotyrleuhishisphe

435440445

alatyraspproglntyrpheleuasngluleuaspleuleuglygln

450455460

alaalaalathrglnleualaargasnileserasnserglyalamet

465470475480

glnthrtyrphealaglygluthrileproglyaspasnleualatyr

485490495

aspalaaspleuseralatrpthrglutyrileprotyrhisphearg

500505510

proasntyrhisglyvalglythrcyssermetmetprolysglumet

515520525

glyglyvalvalaspasnalaalaargvaltyrglyvalglnglyleu

530535540

argvalileaspglyserileproprothrglnmetserserhisval

545550555560

metthrvalphetyralametalaleulysileseraspalaileleu

565570575

gluasptyralasermetgln

580

<210>2

<211>1752

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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gactacatcatcgctggtggaggtctgactggactcaccaccgctgctcgtctgacggag120

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