一种啤酒有害菌选择性培养基及其应用的制作方法

本发明属于啤酒技术领域，特别涉及一种啤酒有害菌选择性培养基。

背景技术：

目前，啤酒行业主要采用德国进口的NBB培养基和MRS培养基检测包括乳酸杆菌和四联球菌在内的典型啤酒有害菌。在检出时间上，不同种属的啤酒有害菌在培养基上所需的生长时间不同，容易生长的啤酒有害菌，可2-3天检出，而部分对啤酒有严重危害却难培养的厌氧菌和微好氧菌，则需要7天以上甚至更长的培养时间，如耐乙酸乳杆菌的检出时间有时高达20天以上。对于有些检测项目，NBB培养基和MRS培养基的培养时间为10天，而部分检测项目更要求培养时间高达20天。

NBB培养基和MRS培养基是基于欧洲啤酒特性研发的，国内啤酒大多具有高辅料比、低苦味值、低酒精度等特点，与欧洲啤酒存在较大差异，故这两种培养基对部分出现在国内啤酒中的啤酒有害菌的检出针对性弱，所需培养时间长，而对醋酸菌、肠细菌等非啤酒有害菌存在选择性不足的缺点。例如，生产上对珠江啤酒首次发现的耐乙酸乳杆菌的检出时间高达20天以上，四联球菌检出时间达7-10天。利用现有的这些培养基来检测啤酒有害菌，检测结果严重滞后于生产，无法满足对啤酒生产中易感微生物的控制需要。同时，过长的检出时间也制约了啤酒的发货时间，增加了成品库存时间，提高了仓储成本。

而且，进口培养基存在成本较为昂贵、检测强度高，监控所需人力物力也大大增加了企业的生产成本。

技术实现要素：

为弥补现有技术中存在的不足，本发明提供一种适合中国啤酒高辅料比、低苦味值、低酒精度等特点的选择性啤酒有害菌培养基，利用该培养基能快速、准确地检测出啤酒中存在的啤酒有害菌。

本发明为达到其目的，采用的技术方案如下：

一种啤酒有害菌选择性培养基，每1L培养基中包括如下添加量的各组分：蛋白胨8-13g、酵母浸膏2-6g、番茄汁肉汤3-9g、吐温-80 1-4g、果糖4-10g、麦芽糖8-16g、葡萄糖12-16g、磷酸二氢钾0.5-1.2g、氯化钠0.003-0.009g、七水合硫酸亚铁0.01-0.06g、乙酸钾4-9g、L-半胱氨酸盐酸盐0.2-0.7g、甜菜碱HCl 1-3g、正乙酰葡糖胺0.2-0.4g、碳酸钙0.001-0.006g、苹果酸0.5-1.0g、柠檬二酸胺1-3g、溴甲酚绿30-80ppm、放线菌酮8-20ml、精氨酸0.5-2.0g、叶酸0.1-1.0g。

所述培养基的配制包括如下步骤：

S1、将蛋白胨、酵母浸膏、番茄汁肉汤、吐温-80g、果糖、麦芽糖、葡萄糖、磷酸二氢钾、氯化钠、七水合硫酸亚铁、乙酸钾、L-半胱氨酸盐酸盐、甜菜碱HCl、正乙酰葡糖胺、碳酸钙、苹果酸、柠檬二酸胺、溴甲酚绿、放线菌酮用水溶解，加入啤酒中，混匀，调节pH至5.3±0.1，灭菌；

S2、培养基使用前，将精氨酸和叶酸用水溶解并经膜过滤，然后加至步骤S1的培养基中。将精氨酸和叶酸在灭菌后加入，可以避免两种物质受高温灭菌而造成不同程度的损失，在培养基使用前将精氨酸和叶酸膜过滤后再加入混匀，可以最大程度的保证两种物质的活性。

进一步的，步骤S1中所述啤酒为纯生啤酒。

优选的，步骤S1中所述啤酒为10°P纯生啤酒。

优选的，步骤S1中，所述水和所述啤酒的体积比为1:1。

作为一种具体实施方式，步骤S1中，用氢氧化钠溶液调节pH。

作为一种具体实施方案，所述培养基为固体培养基，在步骤S1中，调节pH后，在灭菌之前向培养基中加入琼脂粉，

进一步的，步骤S1中，琼脂粉在培养基中的质量百分比为1-2％。

本发明第二方面还提供上文所述的啤酒有害菌选择性培养基在检测啤酒有害菌方面的应用。

优选的，啤酒有害菌选择性培养基接种检测样品后的培养条件为：温度26-28℃，厌氧培养。采用该优选培养条件，在厌氧培养下，可选择性培养啤酒有害菌。

本发明提供的技术方案具有如下有益效果：

本发明对现有技术最重要的改进在于保证啤酒有害菌检出率的前提下，大幅缩短了难培养的啤酒有害菌的培养时间，大幅提高了生产检验效率；而且培养基所需成本低，能够有效降低企业生产成本。

本发明开发了一种适合中国啤酒高辅料比、低苦味值、低酒精度等特点的选择性啤酒有害菌培养基，能快速、准确地检测出啤酒中存在的啤酒有害菌，能解决现有培养基并非针对国内啤酒特点而设计的缺陷，并大大降低目前依赖进口培养基的现状。

附图说明

图1是实施例3中Lactobacillus lactis在实施例2的培养基上培养4天(左图)与MRS上培养10天(右图)的平板上的菌落形态对比；

图2是实施例3中Leuconostoc oenos在实施例2(右图)的培养基上与MRS(左图)上培养2天后的结果对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明：

实施例1液体培养基的配制

液体培养基的配方如下表1所示：

表1培养基主要成分

培养基的配制方法如下(以配制1L培养基为例)：

S1、将表1中编号1-19的成分按照表1中的量称量，先用500mL蒸馏水溶解后，再加入500ml 10°P纯生啤酒，混匀。有需要时可水浴加热促进溶解。待所有试剂溶解后，用5mol/L的NaOH调pH至5.3±0.1；

将培养基分装入已灭菌的三角瓶内，塞上塞子，包扎好，115℃，灭菌10min。

S2、培养基使用前，将精氨酸和叶酸按量称好后用10ml蒸馏水一起溶解，在超净台用0.22μm膜过滤，加至培养基中摇匀，即可使用。

S3、无菌检查：取3个装有配好的培养基的平板于26-28℃有氧培养2天，检查是否有细菌生长。

所配制的培养基应置于阴凉干燥处保存，保存期为2个月。

实施例2固体培养基的配制

固体培养基的配制方法如下(以配制1L为例)：

S1、将表1中编号1-19的成分按照表中的量称量，先用500mL蒸馏水溶解后，再加入500ml 10°P纯生啤酒，混匀。有需要时可水浴加热促进溶解。待所有试剂溶解后，用5mol/L的NaOH调pH至5.3±0.1；

将培养基分装入已灭菌的三角瓶内，在瓶中加入1.5％琼脂粉，塞上塞子，包扎好，115℃，灭菌10min。

S2、培养基使用前，将精氨酸和叶酸按量称好后用10ml蒸馏水一起溶解，在超净台用0.22μm膜过滤，待S1所得培养基在水浴溶解后冷却至40-50℃时，将精氨酸和叶酸加至培养基中摇匀，即可使用。

S3、无菌检查：取3个装有配好的培养基的平板于26-28℃有氧培养2天，检查是否有细菌生长。

所配制的培养基应置于阴凉干燥处保存，保存期为2个月。

实施例3标准菌株验证

使用13类啤酒有害菌进行标准验证，接种量在100-1000个/ml时，实施例2的固体培养基与现有的MRS培养基对比、以及实施例1的液体新培养基与现有的NBB培养基对比验证，培养条件均为：培养温度为28℃，厌氧培养。生长天数对比情况如表2所示：

表2：标准菌株在本发明固体培养基与MRS以及本发明液体培养基与NBB-B上生长情况

经过实验室标准菌株验证可知，所有试验菌均能在四种培养基上生长，生长天数见表2所示。在固体培养基上对比验证可知，除L.frigidus和L.brevis在2种菌在培养基上生长天数相当外，其余标准菌株在新开发的固体培养基上比在MRS生长有优势:肉眼可观察到菌落的天数短，且菌落较在MRS上大，易观察，特别是对于L.perolens、Lactobacillus delb.delb、Leuconostoc mes、Lactobacillus acetotorelans、Lactobacillus lactis检出优势尤为突出，由以前的6-10天不等，缩短至2-4天检出。在液体培养基对比验证时，多数菌株比较接近，但是对于L.lindneri、Leuconostoc mes、Lactobacillus acetotorelans的检出时间缩短至7天以内，大大提高了检出速率。

实施例4大生产验证

在啤酒生产过程中，对生产过程中的发酵液55批、回收酵母43批、纯生成品50批、膜前酒液50批、水样20批分别用本发明培养基(具体是实施例1和实施例2的培养基)和传统培养基(具体是NBB和MRS培养基)进行啤酒有害菌检测，培养条件为：培养温度为28℃，厌氧培养。对检测结果的一致性情况进行统计，结果见下表3所示。表3中所述的两种培养基即指本发明培养基和传统培养基。

表3

结果分析：

生产上新旧培养基对比，共计进行218批，其中发酵液55批，回收酵母43批，纯生成品50批，膜前酒液50批，水样20批，具体如下：

本发明培养基与传统的MRS和NBB培养基相比，检测一致性高达94.5％。检测不一致的共7批，占3.2％，其中6批只在传统培养基上生长，经鉴定为酵母或者好氧菌，不属于啤酒有害菌的检测范围内，而由于本发明培养基加入了放线菌酮等物质，可以很好的抑制酵母菌和选择性筛选啤酒有害菌，故这5批没有检出实属正常。剔除后，本发明培养基与传统培养基检测啤酒有害菌的一致率达到99.5％。同时也说明了传统培养基在检测生产上的样品时，由于酵母菌和好氧菌也能在其上生长，造成假阳性的情况，致使传统培养基对啤酒有害菌的选择性不是特别强，相反本发明新开发的培养基由于酵母抑制剂等物质的加入以及较低的pH培养条件，更有利于去除假阳性及确定是否为啤酒有害菌导致的污染。

文中未特别说明之处，均为本领域技术人员根据其掌握的公知常识或现有技术所能理解或知晓的，对此不再一一赘述。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。